INTRODUCTIONLeafhopper, Nephotettix

INTRODUCTION
Leafhopper, Nephotettix virescens Distant
(Hemiptera: Cicadellidae) plays an important role as a
vector of rice tungro virus (Muralidharan et al., 2003;
Widiarta, 2005), while the role of N.virescens as a pest
of rice causing direct damage by feeding is less
important. The tungro disease is one of the most
destructive diseases of rice in South and Southeast Asia,
where disease epidemics have occurred since the mid-
1960s (Azzam & Chancellor, 2002). In Indonesia, tungro
disease is often destruct in endemic areas of Klaten
(Central Java) and Sleman (Yogyakarta) and Bali. The
Tungro disease caused severe damage in Indonesia with
affected area about 16,000 ha in Bali during 1980; 25,000
ha in Bali, Java, Sumatera during 1983–1984; 18,000 ha
in Bali, Java, Sumatera, Kalimantan, Irian Jaya during
1985–1986; and 12,340 ha in Central Java in 1995
(Azzam & Chancellor, 2002), while tungro disease in
Central Java cause damage of 1098 hectares in 2010
(Dinas Pertanian Tanaman Pangan Provinsi Jawa
Tengah, 2010).
Tungro diseases are caused by two viruses
(Hibino, 1996), namely rice tungro spherical virus
(RTSV) and rice tungro bacilliform virus (RTBV).
Generally, RTBV and RTSV together or RTSV alone is
transmitted by leafhopper N. virescens (Choi et al.,
2009). N. virescens was more effective to transmit
the tungro virus (Supriyadi et al., 2004; Widiarta, 2005)
and also its population in the field was more dominant
than other vectors (Supriyadi et al., 2004; Widiarta,
2005).
Interaction between the vector N. virescens and
tungro virus can be complex and a specific pattern. In
the case of insects borne viruses, Nault (1997) and
Fereres & Moreno (2009), showed a specific pattern
of relations between vectors, viral and host plant. The
ability of N. virescens to transmit tungro virus is
individuals, not all individuals in the population to be
competent as a vector. Among the population of the
leafhopper, there are individuals able to transmit the virus
and not able to transmit the virus (Gray & Banerjee,
1999). Individuals of N. virescens that can transmit the
virus after acquisition feeding are called active
transmitter, while the one that can not transmit a virus
called the non-transmitters (Ling, 1972).
The characters of N. virescens active
transmitters from endemic area of tungro disease in
Indonesia have not been well characterized, only limited
information was available. Research conducted by
Supriyadi et al. (2004) showed relationship between
proportion of N. virescens active transmitters and
endemic areas of tungro disease. Average proportion
of N. virescens active transmitters from endemic area
of tungro disease was 81%, whereas from non endemic
area was 52.2%. Meanwhile, the results of different
studies indicated that the total protein banding pattern
of N. virescens active transmitters were different from
the non transmitters, but there were no the variation of
external morphology (Supriyadi & Wijayanti, 2010).
The efforts to understand the genetic variation in
insect populations often require studies at molecular level.
According to Brooker (1999), gene expressions were
not always different in morphology, but may also different
in the molecular-product or physiological properties. The
Randomly Amplified Polymorphic DNA-Polymerase
Chain Reaction (RAPD-PCR) is a technique commonly
used in studies of genetic variation within or between
geographic populations (Naber et al., 2000;
Margaritopoulos et al., 2000; Rampelotti et al., 2008).
However, studies on molecular tagging conferring
N. virescens from endemic and non endemic tungro
disease were limited and lack information on the
character of DNA. There was no report on the use of
RAPD markers N. virescens from endemic areas of
tungro disease in Indonesia was published at this time.
Therefore, efforts to identify the active transmitter of
N. virescens from endemic and non-endemic area of
tungro disease needs to be done. The objective of this
research was to identify the character of N. virescens
active transmitters from endemic and non-endemic areas
of tungro disease based on RAPD markers.
MATERIAL AND METHODS
Study Site.The research was conducted from April to
November 2010. The population of of N. virescens
leafhopper used in this study was collected from field in
an endemic area of rice tungro disease (Klaten, Central
Java and Sleman, Yogyakarta) and non-endemic areas
(Pacitan , East Java; Ngawi, East Java; and Purwodadi,
Central Java). Mass rearing of N. virescens and virus
transmission were conducted at the Laboratory of Pests
and Plant Diseases, Faculty of Agriculture, University
of Sebelas Maret, while identification of the genetic
variations of N. virescens based on RAPD-PCR
markers was performed in the Laboratory of Virology,
Department of Plant Protection, Bogor Agricultural
University.
Rearing of N. virescens Leafhopper. N. virescens
samples, were collected from field using a sweepnet
and then placed in a separate box for each colony. Mass
rearing of N. virescens was conducted according to
Supriyadi & Wijayanti Genetic Variation of Leafhopper, Nephotettix virescens 27
the methods of Dahal et al. (1997) and Cooter et al.
(2000) with modifications of the rice variety and age of
seedling to feed the leafhopper. The susceptible cultivar
of Cisadane was chosen to feed of the leafhopper. One
week-old seedlings of Cisadane were planted in a plastic
boxs 3x7x14 cm in size and then were placed on the
rearing box 40x40x40 cm in size for rearing of
N. virescens.
Identification of N. virescens Active Transmitters.
Identification of N. virescens active transmitters was
carried out through procedure of transmission test
according to Dahal et al. (1997). Adult males of
leafhopper were infested on rice that has been infected
by tungro virus for three days to take feeding acquisition.
After acquisition feeding, the leafhopper was infested
individually on healthy seedlings for inoculation feeding
for three days. After inoculation feeding, the seedling
was planted individually on pots 6 cm of diameter.
The N.virescens active transmitters were
determined by ditermining their ability to transmit tungro
virus after acquisition feeding, according to the criteria
of Ling (1972). The ability of N. virescens to transmit
the virus was based on criteria of the Standard Evaluation
System (SES), with a score of 3, namely shortening of
1-10% of the top leaf, abnormal seedling by shortened
growth, but no yellowish leaf (IRRI, 1996). The
N. virescens active transmitters that have been
identified were stored in 90% alcohol and used as a
sample of DNA extraction.
DNA Extraction. Procedure of RAPD-PCR was
conducted through three main steps, namely DNA
extraction, PCR amplification and DNA visualization.
The first step of RAPD-PCR was the preparation of
the target DNA template. The N. virescens active
transmitter male was used to isolate DNA template.
Males N. virescens were used as sample because of
their smaller body and lower protein contents, so did
not interfere in PCR amplification. Genome DNA initially
was extracted by modified method from Hidayat et al.
(1996). Homogenizaton of three green leafhoppers,
N. virescens active transmitter carried out in a
microcentrifuge tube using a plastic micro-pestle. Whole
insects were macerated in 125 µl of extraction buffer
(2% CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM TrisHCl
pH 8, 0) and incubated at 60 °C for 30 min. Then
was added one volume of chloroform: isoamyl alcohol
(24:1) and homogenized by vortex. Subsequently, the
samples were centrifuged for 5 min at 800 rpm.
Supernatant was transferred to a new tube, were added
10 µl of 3 M NaOAc and 250 µl of absolute ethanol,
than the supernatants was incubated at -20 °C for 30
min and centrifuged at 11,500 rpm for 15 min. After
centrifugation, supernatant was discarded and the pellet
was washed with 200 ml of 0.2 M solution of ammonium
acetate in 70% ethanol and centrifuged at 11,500 rpm
for 2 min. Ethanol was discarded and the pellet was
dried in a vacuum pump for 10 min. Pellet was then
resuspended in 10 ml of sterile water and stored at
-20 °C. DNA concentration of each sample was
quantified by using spectrophotometer, while the quality
of DNA was checked by electrophoresis on 1.4%
agarose.
DNA Amplification. The RAPD-PCR amplification
was a step to led of DNA bands from identified samples.
RAPD-PCR amplification step was to lead DNA band
of the sample identified. Amplification of DNA template
of N. virescens was performed as described by Hidayat
et al., (1996). Three selected random primers, namely
OPB 01 (GTT TCG CTC C); OPB10 (CTG CTG GGA
C), and OPC08 (GGT ACC TGG G), ware used to
amplify DNA template. All of the primers were
commonly used to amplify of insects (Loxdale & Lushai,
1998). PCR was carried out in 25 µl volume reaction
mixture. The reaction mixture contained 18.8 µl H2O,
2.5 µl Buffer MgCl2, 0.5 µl dNTP mix 10 mM, 1µl
random primer 10 µM, 0.2 µl Taq DNA polymeration
5 u/µl, and 2 µl DNA template. Tubes containing reaction
mixture were processed into a PCR Thermal Cycler
machine. Amplification reactions were conducted by
using a GenAmp PCR 9700 thermo cycler programmed
to run the following procedure: an initial denaturation 1
cycle at 95 °C for 5 min; 45 cycles consisting each of a
denaturation step at 94°C for 1 min; an annealing step
at 36 °C for 1 min; extension at 72 °C for 2 min and
final elongation/extension at 72 °C for 5 min. The
products of each PCR were visualized in running
electrophoresis in 1.4% agarose gels at 60 V for 7 hr in
TAE buffer. The gels were stained using ethidium
bromide. The results were observed in a
transillumination UV light (UV) and photodocumented.
Data Analysis. Data analysis was conducted on the
difference variability of N. virescens came from
endemic and non-endemic areas studied. Gel
electrophoresis products, after being photographed were
analyzed for the presence of visual criteria. DNA bands
profile of N. virescens active transmitter

Hasil (Bahasa Indonesia) 1:

PENDAHULUANLeafhopper, Nephotettix virescens jauh(Hemiptera: Cicadellidae) berperan sebagaivektor beras tungro virus (Muralidharan et al., 2003;Widiarta, 2005), sementara peranan N.virescens sebagai hamaberas yang menyebabkan kerusakan langsung dengan memberi makan adalah kurangpenting. Penyakit tungro adalah salah satu yang palingpenyakit yang merusak beras di Selatan dan Asia Tenggara,mana epidemi penyakit telah terjadi sejak pertengahan-1960-an (Azzam & Chancellor, 2002). Di Indonesia, tungropenyakit sering merusak di daerah endemik Klaten(Jawa Tengah) dan Sleman (Yogyakarta) dan Bali. ThePenyakit Tungro yang menyebabkan kerusakan parah di Indonesia dengandaerah yang terkena sekitar 16.000 ha di Bali selama 1980; 25.000Ha di Bali, Jawa, Sumatera selama 1983-1984; 18.000 hadi Bali, Jawa, Sumatera, Kalimantan, Irian Jaya selama1985-1986; dan 12,340 ha di Jawa Tengah pada tahun 1995(Azzam & Chancellor, 2002), sementara tungro penyakit dalamJawa Tengah merusak 1098 hektar di 2010(Dinas Pertanian Tanaman Pangan Propinsi JawaTengah, 2010).Tungro penyakit yang disebabkan oleh dua virus(Hibino, 1996), yaitu beras tungro bulat virus(RTSV) dan beras tungro bacilliform virus (RTBV).Umumnya, RTBV dan RTSV bersama-sama atau RTSV sendiri adalahdikirimkan oleh leafhopper N. virescens (Choi et al.,2009). N. virescens ini lebih efektif untuk mengirimkanvirus tungro (Supriyadi et al., 2004; Widiarta, 2005)dan juga populasi di bidang lebih dominandaripada lain vektor (Supriyadi et al., 2004; Widiarta,2005).Interaksi antara vektor N. virescens danTungro virus dapat menjadi kompleks dan pola tertentu. Dalamkasus serangga yang ditanggung virus, Nault (1997) danFereres & Moreno (2009), menunjukkan pola tertentuhubungan antara vektor, virus dan tanaman inang. Thekemampuan N. virescens untuk mengirimkan tungro virus adalahindividu, tidak semua individu dalam populasi haruskompeten sebagai vektor. Di antara populasileafhopper, orang dapat mengirimkan virusdan tidak mampu menularkan virus (abu-abu & Banerjee,1999). individu N. virescens yang dapat mengirimkanvirus setelah akuisisi makan disebut aktifpemancar, sedangkan yang tidak dapat mengirimkan virusdisebut bebas-pemancar (Ling, 1972).Karakter N. virescens aktifpemancar dari daerah endemik tungro penyakit dalamIndonesia memiliki belum baik ditandai, hanya dibatasiinformasi yang tersedia. Penelitian yang dilakukan olehSupriyadi et al. (2004) menunjukkan hubungan antaraproporsi N. virescens aktif pemancar dandaerah endemik tungro penyakit. Rata-rata proporsidari N. virescens pemancar aktif dari daerah endemiktungro penyakit adalah 81%, sedangkan dari penyebaran bebaswilayah ini 52.2%. Sementara itu, hasil berbedastudi menunjukkan bahwa protein total banding polan virescens aktif pemancar yang berbeda daripemancar bebas, tapi ada tidak ada variasieksternal morfologi (Supriyadi & Wijayanti, 2010).Upaya untuk memahami variasi genetikpopulasi serangga sering membutuhkan studi di tingkat molekuler.Menurut Brooker (1999), adalah ekspresi gentidak selalu berbeda dalam morfologi, tetapi juga berbeda Meidalam properti molekul-produk atau fisiologis. TheSecara acak diperkuat polimorfik DNA-polimeraseReaksi berantai (amplifikasi acak polimorfisme DNA-PCR) adalah teknik umumdigunakan dalam studi genetik variasi dalam atau antarageografis populasi (Naber et al., 2000;Margaritopoulos et al., 2000; Rampelotti et al., 2008).Namun, studi pada molekul penandaan berundingN. virescens dari tungro endemik dan bebas endemikpenyakit terbatas dan kurangnya informasi padakarakter DNA. Ada tidak ada laporan tentang penggunaanAmplifikasi acak polimorfisme DNA spidol N. virescens dari daerah endemikTungro penyakit di Indonesia diterbitkan pada saat ini.Oleh karena itu, upaya untuk mengidentifikasi pemancar aktifN. virescens dari daerah endemik dan bebas-endemikTungro penyakit yang perlu dilakukan. Tujuan dari iniPenelitian ini untuk mengidentifikasi karakter N. virescenspemancar aktif dari daerah endemik dan bebas-endemiktungro penyakit berdasarkan amplifikasi acak polimorfisme DNA spidol.BAHAN DAN METODEStudi penelitian ini dilakukan dari bulan April hingga Site.TheNovember 2010. Penduduk dari N. virescensleafhopper yang digunakan dalam penelitian ini dikumpulkan dari field didaerah endemik beras tungro penyakit (Klaten, CentralJawa dan Sleman, Yogyakarta) dan non-endemik daerah(Pacitan, Jawa Timur; Ngawi, Jawa Timur; dan PurwodadiJawa Tengah). Massa membesarkan N. virescens dan virustransmisi dilakukan di laboratorium hamadan penyakit tanaman, Fakultas Pertanian, Universitasdari Sebelas Maret, sementara identifikasi genetikvariasi dari N. virescens berdasarkan PCR amplifikasi acak polimorfisme DNApenanda dilakukan di laboratorium virologiPerlindungan Departemen tanaman, Pertanian BogorUniversitas.Pemeliharaan N. virescens Leafhopper. N. virescenssampel, dikumpulkan dari bidang menggunakan sweepnetdan kemudian ditempatkan di sebuah kotak yang terpisah untuk setiap koloni. Massapemeliharaan N. virescens dilakukan menurut Supriyadi & Wijayanti genetik variasi dari Leafhopper, Nephotettix virescens 27metode Dahal et al. (1997) dan Cooter et al.(2000) dengan modifikasi varietas padi dan usiabibit untuk pakan leafhopper. Budidaya rentandari Cisadane dipilih untuk memberi makan dari leafhopper. Salah satubibit seminggu Cisadane ditanam dalam plastikkotak 3 x 7 x 14 cm dalam ukuran dan kemudian ditempatkan padamembesarkan kotak 40 x 40 x 40 cm dalam ukuran untuk pemeliharaanN. virescens.Identifikasi N. virescens aktif pemancar.Identifikasi N. virescens pemancar aktif adalahdilakukan melalui prosedur pengujian transmisiMenurut Dahal et al. (1997). Laki-laki dewasa darileafhopper yang penuh beras yang telah terinfeksioleh tungro virus selama tiga hari untuk mengambil makan akuisisi.Setelah akuisisi makan, leafhopper penuhsecara individual pada bibit yang sehat untuk makan inokulasiselama tiga hari. Setelah makan, inokulasi bibitditanam secara individual pada pot 6 cm diameter.N.virescens yang sedang aktif pemancarditentukan oleh ditermining kemampuan mereka untuk mengirimkan tungrovirus setelah akuisisi makan, menurut kriteriaLing (1972). Kemampuan N. virescens untuk mengirimkanvirus ini didasarkan pada kriteria evaluasi standarSistem (SES), dengan Skor 3, yaitu memperpendek dari1-10% teratas daun, abnormal bibit oleh disingkatpertumbuhan, tetapi tidak ada daun kekuningan (IRRI, 1996). TheN. virescens aktif pemancar yang telahdiidentifikasi disimpan dalam 90% alkohol dan digunakan sebagaicontoh DNA ekstraksi.Isolasi DNA. Prosedur PCR amplifikasi acak polimorfisme DNAdilakukan melalui tiga langkah utama, yaitu DNAekstraksi, PCR amplifikasi dan DNA visualisasi.Langkah pertama dari PCR amplifikasi acak polimorfisme DNA adalah persiapantarget DNA template. Virescens N. yang aktifLaki-laki pemancar digunakan untuk mengisolasi DNA template.Laki-laki N. virescens digunakan sebagai sampel karenatubuh yang lebih kecil dan isi protein yang lebih rendah, mereka begitu pulatidak mengganggu dalam PCR amplifikasi. Genom DNA awalnyadiambil oleh metode diubah dari Hidayat et al.(1996). Homogenizaton dari tiga wereng hijau,N. virescens aktif pemancar dilakukan diMicrocentrifuge tabung menggunakan plastik mikro-alu. Seluruhserangga yang dimaserasi di 125 μL ekstraksi buffer(CTAB 2%, NaCl M 1.4, 20 mM EDTA, 100 mM TrisHClpH 8, 0) dan diinkubasi di 60 ° C selama 30 menit kemudian cycling kemudianditambahkan satu volume kloroform: isoamyl alkohol(24:1) dan disamakan oleh vortex. Selanjutnya,sampel yang disentrifugasi selama 5 menit pada 800 rpm.Supernatant dipindahkan ke tabung baru, ditambahkan10 μL dari 3 M NaOAc dan 250 μL etanol absolut,daripada supernatants diinkubasi pada 20 ° C selama 30min dan disentrifugasi pada 11.500 rpm 15 menit kemudian setelahsentrifugasi, supernatant dibuang dan peletdicuci dengan 200 ml larutan 0.2 M amoniumasetat dalam 70% etanol dan disentrifugasi pada 11.500 rpmuntuk 2 min. etanol dibuang dan pelet adalahkering di pompa vakum untuk 10menit Pellet kemudianresuspended dalam 10 ml air steril dan disimpan di-20 ° C. Adalah DNA konsentrasi setiap sampeldiukur dengan menggunakan spectrophotometer, sementara kualitasDNA telah diperiksa oleh Elektroforesis pada 1,4%Agarose.Amplifikasi DNA. Amplifikasi acak polimorfisme DNA-PCR amplifikasipada langkah untuk dipimpin DNA band dari sampel diidentifikasi.Amplifikasi acak polimorfisme DNA-PCR amplifikasi langkah adalah untuk membawa DNA bandsampel diidentifikasi. Amplifikasi DNA templaten virescens dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Hidayatet al., (1996). Tiga dipilih acak primers, yaituOPB 01 (GTT TCG CTC C); OPB10 (CTG CTG GGAC), dan OPC08 (GGT ACC TGG G), ware digunakan untukmemperkuat DNA template. Semua yang primersumumnya digunakan untuk memperkuat serangga (Loxdale & Lushai,1998). PCR dilaksanakan dalam 25 μL volume reaksicampuran. Campuran reaksi terkandung 18.8 μL H2O,2.5 μL buffer MgCl2, 0.5 μL dNTP campuran 10 mM, 1µlacak primer 10 µM, 0.2 μL Taq DNA polymerationu/μL 5, dan 2 μL DNA template. Tabung yang mengandung reaksicampuran yang diolah menjadi pengendara sepeda termal PCRmesin. Amplifikasi reaksi dilakukan olehmenggunakan pengendara sepeda thermo GenAmp PCR 9700 yang diprogramuntuk menjalankan prosedur berikut: denaturasi awal 1siklus di 95 ° C selama 5 menit; 45 siklus terdiri masing-masingDenaturasi langkah pada 94° C selama 1 menit; langkah Anildi 36 ° C selama 1 menit; ekstensi di 72 ° C selama 2 menit danakhir elongasi renovasi pada 72 ° C selama 5 menit.Produk PCR setiap yang dibayangkan dalam menjalankanElektroforesis di 1,4% agarose gel 60 V untuk 7 hrTAE buffer. Gel yang bernoda menggunakan ethidiumbromida. Hasil yang diamati padacahaya transillumination UV (UV) dan photodocumented.Analisis data. Analisis data dilaksanakan padaperbedaan variabilitas N. virescens datang darimempelajari daerah endemik dan bebas-endemik. GelElektroforesis produk, setelah difoto itudianalisis untuk kehadiran visual kriteria. DNA bandProfil N. virescens aktif pemancar

Hasil (Bahasa Indonesia) 2:

PENDAHULUAN
wereng, Nephotettix virescens Distant
(Hemiptera: Cicadellidae) memainkan peranan penting sebagai
vektor virus tungro (Muralidharan et al, 2003;.
Widiarta, 2005), sedangkan peran N.virescens sebagai hama
padi menyebabkan kerusakan langsung oleh makan kurang
penting. Penyakit tungro merupakan salah satu yang paling
merusak penyakit beras di Asia Selatan dan Tenggara,
di mana epidemi penyakit telah terjadi sejak pertengahan
tahun 1960-an (Azzam & Kanselir, 2002). Di Indonesia, tungro
penyakit sering merusak di daerah endemik Klaten
(Jawa Tengah) dan Sleman (Yogyakarta) dan Bali. The
Penyakit Tungro menyebabkan kerusakan parah di Indonesia dengan
daerah yang terkena sekitar 16.000 ha di Bali pada tahun 1980; 25.000
ha di Bali, Jawa, Sumatera selama 1983-1984; 18.000 ha
di Bali, Jawa, Sumatera, Kalimantan, Irian Jaya selama
1985-1986; dan 12.340 ha di Jawa Tengah pada tahun 1995
(Azzam & Kanselir, 2002), sementara penyakit tungro di
Jawa Tengah menyebabkan kerusakan dari 1.098 hektar pada tahun 2010
(Dinas Pertanian Tanaman Pangan Provinsi Jawa
Tengah, 2010).
Penyakit Tungro disebabkan oleh dua virus
(Hibino , 1996), yaitu virus tungro spherical
(RTSV) dan beras tungro bacilliform virus (RTBV).
Umumnya, RTBV dan RTSV bersama-sama atau RTSV saja yang
ditularkan oleh wereng virescens N. (Choi et al.,
2009). N. virescens lebih efektif untuk mengirimkan
virus tungro (Supriyadi et al, 2004;. Widiarta, 2005)
dan juga penduduknya di lapangan adalah lebih dominan
daripada vektor lainnya (Supriyadi et al, 2004;. Widiarta,
2005).
Interaksi antara virescens vektor N. dan
virus tungro dapat menjadi kompleks dan pola tertentu. Dalam
kasus serangga ditanggung virus, Nault (1997) dan
Fereres & Moreno (2009), menunjukkan pola tertentu
dari hubungan antara vektor, virus dan tanaman inang. The
Kemampuan N. virescens menularkan virus tungro adalah
individu, tidak semua individu dalam populasi menjadi
kompeten sebagai vektor. Di antara populasi
wereng, ada individu dapat menularkan virus
dan tidak dapat menularkan virus (Gray & Banerjee,
1999). Individu dari N. virescens yang dapat menularkan
virus setelah makan akuisisi disebut aktif
pemancar, sedangkan yang tidak dapat menularkan virus
yang disebut non-pemancar (Ling, 1972).
Karakter dari N. virescens aktif
pemancar dari daerah endemik penyakit tungro di
Indonesia belum ditandai dengan baik, hanya terbatas
informasi yang tersedia. Penelitian yang dilakukan oleh
Supriyadi et al. (2004) menunjukkan hubungan antara
proporsi N. virescens pemancar aktif dan
daerah endemik penyakit tungro. Proporsi rata-rata
dari N. virescens pemancar aktif dari daerah endemik
penyakit tungro adalah 81%, sedangkan dari non endemik
daerah adalah 52,2%. Sementara itu, hasil yang berbeda
penelitian menunjukkan bahwa pola pita protein Total
dari N. virescens pemancar aktif yang berbeda dari
non pemancar, tetapi tidak ada variasi
morfologi eksternal (Supriyadi & Wijayanti, 2010).
Upaya untuk memahami genetik variasi dalam
populasi serangga sering memerlukan studi di tingkat molekuler.
Menurut Brooker (1999), ekspresi gen yang
tidak selalu berbeda dalam morfologi, tetapi mungkin juga berbeda
dalam molekul-produk atau sifat fisiologis. The
acak Amplified Polymorphic DNA-Polymerase
Chain Reaction (PCR-RAPD) adalah teknik yang biasa
digunakan dalam studi variasi genetik di dalam atau di antara
populasi geografis (Naber et al, 2000;.
Margaritopoulos et al, 2000;. Rampelotti et al, 2008. ).
Namun, studi tentang penandaan molekul berunding
N. virescens dari tungro endemik endemik dan non
penyakit yang terbatas dan kurang informasi tentang
karakter DNA. Tidak ada laporan tentang penggunaan
penanda RAPD virescens N. dari daerah endemik
penyakit tungro di Indonesia diterbitkan pada saat ini.
Oleh karena itu, upaya untuk mengidentifikasi pemancar aktif
N. virescens dari daerah endemik dan non-endemik
kebutuhan penyakit tungro dilakukan. Tujuan dari
penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi karakter N. virescens
pemancar aktif dari daerah endemik dan non-endemik
penyakit tungro berdasarkan penanda RAPD.
BAHAN DAN METODE
Penelitian Studi site.The dilakukan dari bulan April sampai
November 2010. Populasi N. virescens
wereng yang digunakan dalam penelitian ini dikumpulkan dari lapangan di
daerah endemik penyakit tungro padi (Klaten, Central
Java dan Sleman, Yogyakarta) dan daerah non-endemik
(Pacitan, Jawa Timur, Ngawi, Jawa Timur, dan Purwodadi,
Jawa Tengah). Pemeliharaan massa N. virescens dan virus
transmisi dilakukan di Laboratorium Hama
dan Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas
Sebelas Maret, sementara identifikasi genetik
variasi N. virescens berdasarkan RAPD-PCR
penanda dilakukan di Laboratorium Virologi,
Departemen Proteksi Tanaman, Bogor Agricultural
University.
Pemeliharaan N. virescens wereng. N. virescens
sampel, dikumpulkan dari lapangan dengan menggunakan sebuah sweepnet
dan kemudian ditempatkan dalam kotak terpisah untuk setiap koloni. Massa
membesarkan N. virescens dilakukan menurut
Supriyadi & Wijayanti genetik Variasi wereng, Nephotettix virescens 27
metode Dahal et al. (1997) dan Cooter et al.
(2000) dengan modifikasi dari varietas padi dan umur
bibit untuk memberi makan wereng tersebut. Kultivar rentan
Cisadane dipilih untuk memberi makan wereng tersebut. Satu
bibit minggu-lama Cisadane ditanam di plastik
boxs 3x7x14 cm dan kemudian ditempatkan pada
kotak pemeliharaan 40x40x40 cm untuk membesarkan
N. virescens.
Identifikasi N. virescens Pemancar aktif.
Identifikasi N. virescens pemancar aktif yang
dilakukan melalui prosedur pengujian transmisi
menurut Dahal et al. (1997). Laki-laki dewasa dari
wereng yang penuh beras yang telah terinfeksi
oleh virus tungro selama tiga hari untuk mengambil makan akuisisi.
Setelah makan akuisisi, wereng itu penuh
individual pada bibit yang sehat untuk inokulasi makan
selama tiga hari. Setelah makan inokulasi, bibit
ditanam secara individual pada pot 6 cm diameter.
The N.virescens pemancar aktif yang
ditentukan oleh ditermining kemampuan mereka untuk mengirimkan tungro
virus setelah makan akuisisi, sesuai dengan kriteria
dari Ling (1972). Kemampuan N. virescens untuk mengirimkan
virus didasarkan pada kriteria Evaluasi Standar
System (SES), dengan skor 3, yaitu memperpendek dari
1-10% dari daun atas, bibit yang abnormal oleh dipersingkat
pertumbuhan, tapi tidak ada kekuningan daun (IRRI, 1996). The
N. virescens pemancar aktif yang telah
diidentifikasi disimpan di 90% alkohol dan digunakan sebagai
sampel DNA ekstraksi.
Ekstraksi DNA. Prosedur RAPD-PCR
dilakukan melalui tiga langkah utama, yaitu DNA
ekstraksi, amplifikasi PCR dan visualisasi DNA.
Langkah pertama RAPD-PCR adalah penyusunan
template DNA target. N. virescens aktif
pemancar laki-laki digunakan untuk mengisolasi DNA template.
Pria N. virescens yang digunakan sebagai sampel karena
tubuh mereka lebih kecil dan isi protein rendah, jadi
tidak ikut campur dalam PCR amplifikasi. Genom DNA awalnya
diekstraksi dengan metode modifikasi dari Hidayat et al.
(1996). Homogenizaton tiga wereng hijau,
N. virescens pemancar aktif dilakukan dalam
tabung microcentrifuge menggunakan micro-alu plastik. Seluruh
serangga dimaserasi dalam 125 ml buffer ekstraksi
(2% CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM TrisHCl
pH 8, 0) dan diinkubasi pada 60 ° C selama 30 menit. Kemudian
ditambahkan satu volume kloroform: isoamil alkohol
(24: 1) dan dihomogenisasi dengan vortex. Selanjutnya,
sampel disentrifugasi selama 5 menit pada 800 rpm.
Supernatan dipindahkan ke tabung baru, ditambahkan
10 ml 3 M NaOAc dan 250 ml etanol absolut,
dari supernatan diinkubasi pada -20 ° C selama 30
menit dan disentrifugasi pada 11.500 rpm selama 15 menit. Setelah
sentrifugasi, supernatan dibuang dan pelet
dicuci dengan 200 ml 0,2 M larutan amonium
asetat dalam etanol 70% dan disentrifugasi pada 11.500 rpm
selama 2 menit. Etanol dibuang dan pelet itu
dikeringkan dalam pompa vakum selama 10 menit. Pelet kemudian
resuspended dalam 10 ml air steril dan disimpan pada
-20 ° C. Konsentrasi DNA dari masing-masing sampel
diukur dengan menggunakan spektrofotometer, sedangkan kualitas
DNA diperiksa dengan elektroforesis pada 1,4%
agarose.
DNA amplifikasi. The RAPD-PCR amplifikasi
adalah langkah untuk memimpin band DNA dari sampel diidentifikasi.
RAPD-PCR amplifikasi langkah adalah memimpin pita DNA
dari sampel diidentifikasi. Amplifikasi template DNA
dari N. virescens dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Hidayat
et al., (1996). Tiga primer acak yang dipilih, yaitu
OPB 01 (GTT TCG CTC C); OPB10 (CTG CTG GGA
C), dan OPC08 (GGT ACC TGG G), barang yang digunakan untuk
memperkuat DNA template. Semua primer yang
umum digunakan untuk memperkuat serangga (Loxdale & Lushai,
1998). PCR dilakukan di 25 ml reaksi Volume
campuran. Campuran reaksi yang terkandung 18,8 H2O ml,
2,5 ml Buffer MgCl2, 0,5 ml campuran dNTP 10 mM, 1μl
acak primer 10 pM, 0,2 ml Taq DNA polimerisasi
5 u / ml, dan 2 ml DNA template. Tabung yang mengandung reaksi
campuran yang diolah menjadi PCR Cycler Thermal
mesin. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan
menggunakan GenAmp PCR 9700 thermo pengendara sepeda diprogram
untuk menjalankan prosedur berikut: sebuah awal denaturasi 1
siklus pada 95 ° C selama 5 menit; 45 siklus yang terdiri dari masing-masing
langkah denaturasi pada 94 ° C selama 1 menit; langkah anil
pada 36 ° C selama 1 menit; ekstensi pada 72 ° C selama 2 menit dan
akhir perpanjangan / ekstensi pada 72 ° C selama 5 menit. The
produk masing-masing PCR divisualisasikan dalam menjalankan
elektroforesis di 1,4% agarose gel pada 60 V selama 7 jam di
TAE penyangga. Gel yang bernoda menggunakan ethidium
bromide. Hasil yang diamati dalam
cahaya transillumination UV (UV) dan photodocumented.
Analisis Data. Analisis data dilakukan pada
variabilitas perbedaan virescens N. berasal dari
daerah endemik dan non-endemik dipelajari. Gel
elektroforesis produk, setelah difoto sedang
dianalisis untuk kehadiran kriteria visual. Pita DNA
profil dari N. virescens pemancar aktif