Fosfatase reaksi. Peptida Desalted

Fosfatase reaksi. Peptida Desalted dari setiap lys-C mencerna tersebut dibagi menjadi dua tabung sama lalu dilarutkan dalam fosfatase reaksi buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM Mg Cl.sub.2 [DTT] dan 1 mM; pH 7.9). Betis intestinal fosfatase (1,000 unit; CIP; New England BioLabs) tidak incubated dengan satu tabung untuk dephosphorylate yang phosphopeptides. Untuk tabung yang lain, tidak CIP ditambahkan. Reaksi ini dilakukan untuk kedua tabung di [37] 2 derajat C untuk h. Tanggapan yang mati dengan TFA untuk konsentrasi akhir tahun 0.5%.

Untuk menilai fosfatase efisiensi, 0.5 mg aliquots dari paralel mock- dan phosphatase-treated sampel yang diperkaya untuk phosphopeptides menggunakan afinitas immobilized logam Kromatografi seperti yang dijelaskan sebelumnya (41). LC-MS/MS analisis menghasilkan identifikasi 720 phosphopeptides (tidak) di balik temuan mocktreated sampel. Tidak phosphopeptides terdeteksi dalam sampel diperlakukan dengan 1% palsu penemuan tinggi. Penting untuk dicatat bahwa reaksi terjadi pada Peptida dan tidak protein. Kami tidak menemukan bias terhadap semua situs di tingkat peptide dengan CIP.

Fosforilasi situs stoichiometry. Ragi yang unggulan, tumbuh dan tiga eksperimen yang terpisah. Untuk setiap ditiru, lysate adalah proteolyzed dengan endoproteinase lys-C. Dua 0.5 mg peptide aliquots dikenakan baik untuk fosfatase perawatan atau mengolok-olok reaksi. Setelah reaksi, Peptida dalam phosphatase-treated sampel kimia yang dilabeli oleh reductive dimethylation menggunakan deuteroformaldehyde untuk dimethylate bebas amines (29). The mengolok-olok reaksi kimia survei ini dilabeli oleh reductive dimethylation menggunakan formalin. Kedua aliquots campuran itu kemudian, yang mengakibatkan 1:1 rasio dari hampir semua Peptida dianalisis oleh LC-mass Gas-Spektrometri teknik. Namun, urutan memberikan Fosforilasi akan mengakibatkan peningkatan tingkat mereka langsung proporsional terhadap jumlah terbelenggu oleh phosphorylation.

Hasil (Bahasa Indonesia) 1:

Fosfatase reaksi. Peptida Desalted dari setiap lys-C mencerna tersebut dibagi menjadi dua tabung sama lalu dilarutkan dalam fosfatase reaksi penyangga (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM dan Mg Cl.sub.2 [DTT] 1 mM; pH 7,9). Betis usus fosfatase (1.000 unit; CIP; New England BioLabs) tidak diinkubasi dengan satu tabung untuk dephosphorylate yang dapat. Untuk tabung yang lain, tidak CIP ditambahkan. Reaksi ini dilakukan untuk kedua tabung di [37] 2 derajat C untuk h. Tanggapan yang mati dengan TFA untuk konsentrasi akhir tahun 0,5%.Untuk menilai fosfatase efisiensi, 0,5 mg aliquots dari paralel mock-dan diperlakukan fosfatase sampel yang diperkaya untuk dapat menggunakan afinitas bergerak logam Kromatografi seperti yang dijelaskan sebelumnya (41). LC-MS/MS analisis menghasilkan identifikasi 720 dapat (tidak) di balik temuan mocktreated sampel. Tidak dapat terdeteksi dalam sampel diperlakukan dengan 1% palsu penemuan tinggi. Penting untuk dicatat bahwa reaksi terjadi pada Peptida dan tidak protein. Kami tidak menemukan bias terhadap semua situs di tingkat peptida dengan CIP.Fosforilasi situs stoikiometri. Ragi yang unggulan, tumbuh dan tiga eksperimen yang terpisah. Untuk setiap ditiru, lysate adalah proteolyzed dengan endoproteinase lys-C. Dua 0,5 mg peptida aliquots dikenakan baik untuk fosfatase perawatan atau mengolok-olok reaksi. Setelah reaksi, Peptida dalam sampel diperlakukan fosfatase kimia yang dilabeli oleh reduktif dimethylation menggunakan deuteroformaldehyde untuk dimethylate bebas amina (29). Mengolok-olok reaksi kimia survei ini dilabeli oleh reduktif dimethylation menggunakan formalin. Kedua aliquots campuran itu kemudian terjadi, yang mengakibatkan rasio 1:1 dari hampir semua Peptida dianalisis oleh LC-massa Gas-Spektrometri teknik. Namun, urutan memberikan Fosforilasi akan mengakibatkan walinya tingkat mereka langsung Stock terhadap jumlah terbelenggu oleh fosforilasi.

Hasil (Bahasa Indonesia) 2:

Reaksi fosfatase. Peptida desalted Dari SETIAP lys-C mencerna tersebut dibagi Menjadi doa tabung sama kata lalu dilarutkan hearts fosfatase Reaksi penyangga (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM Mg Cl.sub.2 [DTT] Dan 1 mM; pH 7,9). Betis fosfatase usus (1.000 Unit; CIP; New England BioLabs) Tidak diinkubasi DENGAN Satu tabung untuk review dephosphorylate Yang phosphopeptides. Untuk review tabung yang lain, TIDAK CIP ditambahkan. Reaksi Penyanyi dilakukan untuk review kedua tabung di [37] 2 derajat C untuk review h. Tanggapan Yang mati DENGAN TFA untuk review konsentrasi AKHIR TAHUN 0,5%.

UNTUK menilai fosfatase Efisiensi, 0,5 mg aliquot Dari paralel mock- Dan fosfatase-diperlakukan sampel Yang diperkaya phosphopeptides untuk review using afinitas bergerak LOGAM Kromatografi Seperti Yang dijelaskan sebelumnya (41). LC-MS / MS analisis menghasilkan identifikasi 720 phosphopeptides (TIDAK) di balik temuan mocktreated sampel. TIDAK phosphopeptides terdeteksi hearts sampel diperlakukan dengan 1% Palsu penemuan Tinggi. Penting untuk review dicatat bahwa Reaksi Terjadi PADA Peptida Dan TIDAK protein. Kami TIDAK menemukan Bias Terhadap SEMUA situs di Tingkat peptida DENGAN CIP.

Fosforilasi situs stoikiometri. Ragi Yang Unggulan, Tumbuh Dan Tiga eksperimen Yang terpisah. Untuk review SETIAP ditiru, lisat Adalah proteolyzed DENGAN endoproteinase lys-C. Dua 0,5 mg peptida aliquots dikenakan Baik untuk review fosfatase Perawatan ATAU mengolok-olok Reaksi. Penghasilan kena pajak Reaksi, Peptida hearts fosfatase-diperlakukan sampel kimia Yang dilabeli Oleh reduktif dimethylation using deuteroformaldehyde untuk review dimethylate prabayar bebas amina (29). The mengolok-olok Reaksi kimia Pengumpulan Penyanyi dilabeli Oleh reduktif dimethylation using formalin. Kedua aliquots Campuran ITU kemudian, Yang mengakibatkan 1: 1 rasio Dari hampir SEMUA Peptida dianalisis Oleh LC-massa Gas-Spektrometri teknik. Namun, Urutan memberikan fosforilasi akan mengakibatkan peningkatan Tingkat mereka Langsung proporsional Terhadap Jangka Waktu terbelenggu Oleh fosforilasi.