Expression and Purification of Reco

Expression and Purification of Recombinant BEK—Baby hamster kidney cells were transfected with plasmid pNUTHL or pNUTL by a calcium phosphate precipitation method and selected with methotrexate (400 mM). Resistant colonies were pooled and propagated in Dulbecco’s
modified Eagle’s medium with 10% fetal calf serum and ZnCl2 (50 mM). The cells were then washed three times with phosphate-buffered saline and maintained in serum-free Dulbecco’s modified Eagle’s memedium with CaCl2 (0.1 mg/ml). Cells were grown in 1-liter roller bottles, and conditioned medium was collected after 3 days and stored at
220 °C. Medium was applid to a Q Fast Flow column (4 ml; Pharmacia Biotech Inc.) equilibrated with TB, pH 7.6 (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, and 20 mM NaCl). The column was washed with 300 ml of TBS, pH 7.6, and eluted with a 50-ml linear NaCl gradient (20–500 mM) in Tris-HCl, pH 7.6. Proenteropeptidase was detected after activation with trypsin by cleavage of GD4K-NA as described below. Pro-HL-BEK eluted at '260 mM NaCl; pro-L-BEK did not bind to the Q Fast Flow column and was recovered in the flow-through fractions. Active fractions were pooled; dialyzed against TB, pH 7.9; and applied to a Ni21-nitrilotriacetic acid-agarose column (5 ml; QIAGEN Inc.). After washing with 200 ml of TB, pH 7.9, either recombinant pro-HL-BEK or pro-L-BEK was eluted with a 50-ml linear gradient for which the limit buffer was TB, pH 7.9, containing 60 mM imidazole and 500 mM NaCl. The eluted protein was dialyzed against TB, pH 7.6, and applied to a Mono Q column (2 ml; Pharmacia Biotech Inc.). After washing with 30 ml of TB, pH 7.6,
enteropeptidase was eluted with a 30-ml linear NaCl gradient (20–500 mM). Purified recombinant pro-HL-BEK or pro-L-BEK was dialyzed against TB, pH 7.6, and stored at 270 °C.

Hasil (Bahasa Indonesia) 1:

Ekspresi dan pemurnian rekombinan BEK-sel ginjal bayi hamster transfected dengan plasmid pNUTHL atau pNUTL oleh Metoda pengendapan kalsium fosfat dan dipilih dengan methotrexate (400 mM). Tahan koloni menggenang dan disebarkan di Dulbecco'sdiubah Eagle's menengah dengan 10% janin betis serum dan ZnCl2 (50 mM). Sel-sel yang kemudian dicuci tiga kali dengan fosfat-buffered asin dan dijaga dalam bebas serum Dulbecco yang dimodifikasi Eagle's memedium dengan CaCl2 (0, 1 mg/ml). Sel-sel yang ditanam di roller 1-liter botol, dan menengah ber-dikumpulkan setelah 3 hari dan disimpan di220 ° C. Media adalah applid ke Q cepat mengalir kolom (4 ml; Pharmacia Biotech Inc) equilibrated dengan TB, pH 7,6 (20 mM Tris-HCl, pH 7,6 dan 20 mM NaCl). Kolom dicuci dengan 300 ml TBS, pH 7.6, dan eluted dengan 50-ml NaCl linier gradien (20-500 mM) di Tris-HCl, pH 7,6. Proenteropeptidase terdeteksi setelah aktivasi dengan tripsin dengan GD4K-na seperti dijelaskan di bawah. Pro-HL-BEK eluted di ' 260 mM NaCl; Pro-L-BEK Apakah tidak mengikat kolom Q cepat aliran dan ditemukan pada aliran-melalui pecahan. Pecahan aktif yang digabung; dialyzed terhadap TB, pH 7,9; dan diterapkan ke kolom asam-agarose Ni21-nitrilotriacetic (5 mililiter; QIAGEN Inc.). Setelah mencuci dengan 200 ml TB, pH 7,9, rekombinan pro-HL-BEK atau pro-L-BEK eluted dengan 50-ml gradien linear yang membatasi buffer adalah TB, pH 7,9, berisi 60 mM imidazol dan 500 mM NaCl. Eluted protein dialyzed terhadap TB, pH 7.6, dan diterapkan ke kolom Mono Q (2 ml; Pharmacia Biotech Inc.). Setelah mencuci dengan 30 ml TB, pH 7.6,enteropeptidase eluted dengan 30-ml NaCl linier gradien (20-500 mM). Dimurnikan rekombinan pro-HL-BEK atau pro-L-BEK dialyzed terhadap TB, pH 7.6, dan disimpan di 270 ° C.

Hasil (Bahasa Indonesia) 2:

Ekspresi dan Pemurnian sel ginjal hamster Recombinant BEK-Bayi transfected dengan plasmid pNUTHL atau pNUTL dengan metode presipitasi kalsium fosfat dan dipilih dengan methotrexate (400 mM). Koloni tahan dikumpulkan dan disebarkan di Dulbecco ini
dimodifikasi menengah Eagle dengan 10% serum janin sapi dan ZnCl2 (50 mM). Sel-sel kemudian dicuci tiga kali dengan phosphate-buffered saline dan dipelihara di modifikasi memedium Eagle bebas serum Dulbecco dengan CaCl2 (0,1 mg / ml). Sel ditumbuhkan dalam botol rol 1-liter, dan menengah AC dikumpulkan setelah 3 hari dan disimpan pada
220 ° C. Medium applid ke Q Fast Flow kolom (4 ml; Pharmacia Biotech Inc) diseimbangkan dengan TB, pH 7,6 (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, dan 20 mM NaCl). Kolom dicuci dengan 300 ml TBS, pH 7,6, dan dielusi dengan 50 ml linear NaCl gradient (20-500 mM) di Tris-HCl, pH 7,6. Proenteropeptidase terdeteksi setelah aktivasi dengan tripsin oleh pemecahan GD4K-NA seperti yang dijelaskan di bawah ini. Pro-HL-BEK dielusi pada '260 mM NaCl; pro-L-BEK tidak mengikat kolom Q Fast Flow dan pulih dalam fraksi aliran-melalui. Fraksi aktif dikumpulkan; didialisis TB, pH 7,9; dan diterapkan ke kolom asam-agarosa Ni21-nitrilotriacetic (5 ml; QIAGEN Inc.). Setelah mencuci dengan 200 ml TB, pH 7,9, baik rekombinan pro-HL-BEK atau pro-L-BEK dielusi dengan gradien linier 50-ml yang batas penyangga adalah TB, pH 7,9, mengandung 60 mM imidazol dan 500 mM NaCl. Protein dielusi didialisis terhadap TB, pH 7,6, dan diterapkan ke kolom Mono Q (2 ml; Pharmacia Biotech Inc.). Setelah mencuci dengan 30 ml TB, pH 7,6,
enteropeptidase dielusi dengan linear NaCl gradien 30-ml (20-500 mM). Dimurnikan rekombinan pro-HL-BEK atau pro-L-BEK didialisis terhadap TB, pH 7,6, dan disimpan pada 270 ° C.