Vol. 27, 2009, Special Issue 2: S2-

Vol. 27, 2009, Special Issue 2: S2-75–S2-81 Czech J. Food Sci.



(bp) 23 130

9 416








Figure 2. CTAB isolated DNA from papaya fruit tissues flesh and stone. Lane contents: M – HindIII DNA ladder (Fermentas, Canada), 1 – DNA extracted from papaya flesh, 2 – DNA extracted from papaya stone, 3 – extraction control. The high-molecular DNA is indicated by arrow

provided by S. Pecoraro (Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Germany) was explored. IRMM (Institute for Reference Ma-terials and Measurements) reference materials of RoundUp Ready (RR) soya (GM line GTS 40-3-2) were used as positive controls for CaMV 35S pro-moter evaluation. Contents of CaMV 35S promoter equals to RoundUp ready contents (AgBios GM Database). Reference materials BF410a (≥ 0.03% RR soya), BF410b (0.1% RR soya) and BF410d (1% RR soya) were applied in each GM papaya screening PCR. Data were evaluated as recommended the ISO Standard (EN ISO 21571:2002).

Extraction control originated from DNA isola-tion – microtube without any sample for DNA isolation was treated in the same way as other samples. Extraction control serve to check of DNA contamination during isolation process.



MasterMix control (no DNA in reaction) was used for checking of contamination in PCR reagent.

RESULTS AND DISCUSSION

Usually, DNA isolation protocol affect quality and quantity of resulting DNA and possible use for downstream applications (Demeke et al. 2009). As it is not trivial to isolate pure DNA from all food matrices (Chapela et al. 2007; Murray et al. 2009), three different methods for DNA isolation (CTAB, Wizard method, GeneSpin DNA Isolation Kit) from two tissues of papaya fruit (flesh and stone) and from candied papaya were tested.

When extracts were analysed on 0.8% agarose gel by electrophoretic separation, that provides qualitative information on DNA degradation extent (Hübner et al. 1999), high molecular DNAs were not visible except for DNA isolated from papaya stone by CTAB procedure (Figure 2).

Spectrophotometry acknowledges the results showing low concentration of isolated DNA at or under the LOD of the instrument. Results of gel electrophoresis, measurement of DNA quantity and the amplifiability of DNA are summarised in Table 2. As low DNA concentration at detec-tion limit of the apparatus were reached, values reporting DNA purity (A260/A280) were not finally calculated.

For more detailed information, the absorption spectrum from 190 nm to 760 nm was recorded. Relevant peaks at 260 nm were noted in samples isolated by CTAB procedure from fresh fruit flesh and stones only (Figure 3).


(a)


0.11
(A)
Absorbance 0.10
0.05

0.00


(b)



0.11
(A)
Absorbance 0.10

0.05
0.00
300 400 500 600 700 300 400 500 600 700
Wavelength (nm) Wavelength (nm)



Figure 3. Absorption spectrum of CTAB isolated DNA from the papaya stone (a) and the flesh (b)

Hasil (Bahasa Indonesia) 1:

Vol. 27, 2009, khusus edisi 2: S2-75-S2-81 Ceko J. makanan Sci. (bp) 23 1309 416Gambar 2. CTAB terisolasi DNA dari daging jaringan buah pepaya dan batu. Isi Lane: M-HindIII DNA tangga (Fermentas, Kanada), 1-DNA diekstrak dari daging pepaya, 2-DNA yang diekstrak dari pepaya batu, 3-kontrol ekstraksi. Tinggi-molekul DNA yang ditunjukkan oleh panahdisediakan oleh S. Pecoraro (Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Jerman) dieksplorasi. IRMM (lembaga referensi Ma-terials dan pengukuran) bahan referensi dari kedelai RoundUp siap (RR) (GM jalur GTS 40-3-2) digunakan sebagai kontrol positif untuk CaMV 35S pro-moter evaluasi. Isi CaMV 35S promotor setara dengan RoundUp siap isi (AgBios GM Database). Bahan-bahan BF410a referensi (≥ 0.03% RR soya), BF410b (0,1% RR soya) dan BF410d (1% RR soya) yang diterapkan di setiap pepaya GM pemeriksaan PCR. Data dievaluasi sesuai anjuran ISO Standard (EN ISO 21571:2002).Ekstraksi kontrol berasal dari DNA isola-tion – microtube tanpa sampel untuk isolasi DNA diperlakukan dengan cara yang sama sebagai sampel lainnya. Ekstraksi pengendalian melayani untuk memeriksa DNA kontaminasi selama proses isolasi. MasterMix kontrol (tidak DNA dalam reaksi) digunakan untuk memeriksa kontaminasi di PCR reagen.HASIL DAN DISKUSIBiasanya, protokol isolasi DNA mempengaruhi kualitas dan kuantitas dihasilkan DNA dan kemungkinan penggunaan untuk aplikasi hilir (Demeke et al. 2009). Karena tidak sepele untuk mengisolasi murni DNA dari semua makanan matriks (Chapela et al. 2007; Murray et al. 2009), tiga metode yang berbeda untuk isolasi DNA (CTAB, metode Wizard, GeneSpin DNA isolasi Kit) dari dua jaringan buah pepaya (daging dan batu) dan dari manisan pepaya diuji.Kapan ekstrak dianalisis pada 0,8% agarose gel oleh pemisahan electrophoretic, yang menyediakan informasi kualitatif tentang tingkat degradasi DNA DNAs molekul tinggi (Hübner et al. 1999), yang tidak terlihat kecuali DNA yang diisolasi dari batu pepaya oleh prosedur CTAB (gambar 2).Spektrofotometri mengakui hasil menampilkan konsentrasi rendah terisolasi DNA pada atau di bawah LOD instrumen. Hasil Elektroforesis, pengukuran jumlah DNA dan amplifiability DNA yang dirangkum dalam tabel 2. Karena konsentrasi DNA rendah pada batas trojanny-tion aparatur tiba, nilai-nilai pelaporan DNA kemurnian (A260/A280) tidak akhirnya dihitung.Untuk info lebih lanjut, spektrum penyerapan dari 190 nm 760 nm tercatat. Puncak-puncak yang relevan di 260 nm dicatat dalam sampel yang terisolasi oleh prosedur CTAB dari daging buah segar dan batu hanya (gambar 3). () 0.11 (A) Absorbansi 0,10 0,05 0.00 (b) 0.11 (A) Absorbansi 0,10 0,05 0.00 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 Gelombang panjang gelombang (nm) (nm) Gambar 3. Penyerapan spektrum CTAB terisolasi DNA dari batu pepaya (a) dan daging (b).