ABSTRACTAims: To identify novel ant

ABSTRACT
Aims: To identify novel antibiotic-producing microbial strains with unprecedented
pertinence. We hypothesize that site-specific soil samples will contain a variety of antibioticproducing species (APS) with diverse specificity of molecular elements.
Place and Duration of Study: Laboratory of Microbiology, Division of Biological and Health
Sciences, University of Pittsburgh, Bradford, PA-16701, USA, between August 2010 and
May 2011.
Methodology: The environmental soil samples were collected from residential and
recreational sites in Southern, PA, USA at longitude: -76 42 21.7116, latitude: 39 56
35.7252; approximately 201 meters above sea level. Over 70 natural antibiotic-producing
soil bacteria were screened against 19 pathogenic microorganisms. Agar-plug assay was
established to identify the antibiotics’ potency and pathogenic inhibitory index calculations
were employed to measure the inhibitory potential of each isolate; 16S rRNA sequencing
was used for microbial classification.
Results: A total of 71 microorganisms from residential soil demonstrated zones of inhibition
(ZOI), followed by 9 organisms from recreational soil sample. A total of 15 bioactive strains
demonstrated convincing growth inhibitory properties against 16 clinically relevant
pathogens; 40% revealed pDNA presence, of which 67% exhibited stringent potencies
against S. aureus. We observed a highly bioactive residential soil microbiota compared to
recreational soil.
Conclusion: 16S rRNA sequence analysis corroborated several of the species belonging
to Enterobacteriaceae, Xanthomonadaceae, and Bacillaceae. These findings may indicate
a co-evolutionary biosynthesis of novel antibiotics driven by the increase of bioactive
microbiota in residential environments.
Keywords: 16S rRNA; antibiotics; microorganisms; antibiotic potency; zone of inhibition;
pathogens; antibiotic resistance.
1. INTRODUCTION
The microbial products of secondary metabolism carry an important role in human health,
providing roadmaps for the biosynthesis of many synthetic and semi-synthetic drugs. In
nature, microbial bioactive products are present as mycotoxins or bacteriosins derived from
filamentous and non-filamentous bacteria and fungi. The soil-based actinomycetes have
been the source of countless drugs, from streptomycin and actinomycin, to erythromycin and
vancomycin [1]. Natural soil harbors over 109 microorganisms/ gram and provides an ideal
reservoir for bioactive microbiota, which springs virtually all clinical antibiotics used today
[2,3]. Today nearly 500 antibiotics are found each year and over 80% of antibiotics in clinical
use are obtained from soil isolates [1]. These bioactive microorganisms are most abundantly
present at the top few inches of the soil, in soil containing straw and agricultural products
[2,4]. Studies have also suggested that soil from areas containing residential-derived
materials, such as human fecal matter, contains 10-20 times more antibiotic resistant strains
than recreational or industrial soils [5]. Consequently and in addition to the elevated use of
therapeutic drugs in urban or residential environments, residential soils contain exceptionally
high bioactivity and are abundant reservoirs of antibiotic-resistant microorganisms [5,6].
Plasmid-mediated antibiotic producing genes can be acquired environmentally by
transposition from one microorganism to another [2]. The phenomenon of intracellular
plasmid acquisition enables antibiotic-producing bacteria to co-exist with antibiotic-resistant
strains through the synthesis of novel bioactive compounds, which allows them to combat
their continuously evolving antibiotic resistant counterparts [7,8]. This sophisticated coevolutionary adaptation is perpetual within microbial-rich soil and represents a great
reservoir for novel, natural (non-synthesized) antibiotics. The successful advancement of
non-synthetic and synthetic antibiotic therapeutic applications therefore requires constant
identification and characterization of natural antibiotic-producing microorganisms.
Due to their topographical inconvenience, little research has been thoroughly conducted on
residential microenvironments. We aimed to explore the natural antibiotic biosynthesis
potentials of microorganisms isolated from soil collected at residential and recreational sites
and hypothesized that site-specific soil samples will contain a diversity of antibioticproducing strains (APS) with a variety of molecular elements. The molecular characterization
of several isolated growth-inhibitory species revealed plasmid DNA (pDNA) presence.
We observed a higher antibiotic-producing community in residential soil compared to
recreational soil. The diverse microbial population, approximately 105 microorganisms per
gram of soil, displayed copious amounts of soil-dwelling APS against 16 clinically relevant
pathogens; 16S rRNA sequencing revealed unique heterogeneity traits in these APS
2. MATERIALS AND METHOD
2.1 Strains Isolation
Environmental soil samples were collected in Southern, PA, USA from 2010-2011 at
longitude: -76 42 21.7116, latitude: 39 56 35.7252, approximately 201 meters above sea
level. Two primary locations were selected for sample collection: a recreational area with
high human traffic (i.e. 94 yard of an industrial site) and an authorized residential property
with an existent human populace. Collected samples were placed in polyethylene bags and
stored in dark at 4
0
C until analyzed for antimicrobial properties. The soil type obtained at
both locations was MT. Airy-Glenelg-Linganore soil (PA087; soilmap.psu.edu).
Due to the heterogeneous nature of soil samples, three different growth medium, Tryptic Soy
Agar (TSA), Potato Dextrose Agar (PDA), and Nutrient Agar (NA), were utilized for the
emergence and isolation of microorganisms. The antibiotic-producing abilities of the
collected microbiota was tested in triplicates and assayed by growth inhibition zone against
19 clinically relevant pathogenic microorganisms obtained from American Type Culture
Collection (ATCC): Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus
thermophilus, Listeria monocytogenes, Ochrobae anthropic, Staphylococcus sciuri, Kocuria
kristinae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterococcus saccharolyticus, Klebsiella
oxytoca, Streptococcus zooepidemicus, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Serratia
marcescens, Saccharomyces cerevisiae, Micrococcus luteus, Bacillus cereus, and
Pseudomonas fluorescens.
2.2 Primary and Secondary Screening
All pathogenic microorganisms were spread on 90-mm polystyrene petri dishes filled with
TSA, PDA, and NA medium, respectively. The collected bioactive soil samples (1-5g) from
each 112 location were dried at 37ºC and sprinkled (~ 80-100 particles) on dishes spread
with each respective ATCC pathogen. Control plates were merely spread with ATCC
pathogens and incubated at 37ºC. After 48 h incubation period, microorganisms displaying
clear zones of inhibition against the pathogens were sequestered onto plates of respective
medium and assigned numbers. Repeated streaking purified the isolated microorganisms
and single-cell colonies were picked up for further screening and temporary storage at 4ºC in
medium-agar-filled slants. Microorganisms displaying little or no pathogenic inhibitory
properties were retested and discarded if scarce antibiotic biosynthesis persisted. Purified
microorganisms obtained from this primary screening were further tested for growthinhibitory properties by using the perpendicular cross-plate method (PCPM) [9] against all 19
pathogenic microorganisms. Antibiotic-producing isolates were considered as any
microorganisms which inhibited the growth of another microbe within its perimeters [10].
Plates were incubated at 37ºC and analyzed after regular time intervals (12 h, 16 h, 24 h,
and 32h) for zones of inhibition (ZOI) across the junctions. Microorganisms displaying little or
no growth inhibitory properties were retested and discarded if insufficient antibiotic
biosynthesis persisted. APS revealing inhibitory zones against one or more pathogen were
further purified and maintained on agar slants at 4ºC in respective growth medium. The APS
were grown in an orbital shaker incubator at 37ºC overnight in respective liquid culture
medium and rescreened against all 19 ATCC microorganisms using PCPM as
aforementioned
2.1.1 Antibiotic production assay
Due to their potential industrial significance, we aimed to thoroughly investigate antibiotic
secreting abilities among the screened APSs. Secondarily screened APSs and blank
controls were grown in 50 ml of respective liquid growth medium (TSB, PDB, and NB) at
37ºC, 120 rpm for 24 h. Cells were pelleted (OD600 2.2-2.5) by centrifugation at 22ºC,
10,000g for 10 min. The supernatant was collected and evaporated by sterile airflow
incubation at 37ºC. Desiccated supernatant was sterilized and reconstituted in 1 ml
respective growth medium and stored at -20ºC until analyzed for antibiotic properties
through agar-plug assay.
2.3 Agar-Plug Assay
Agar-plug assay was adopted from Bechard et al. [11] with a 5-mm sterile cork borer utilized
to plug wells on respective agar plates (NA, PDA, and TSA) lawned with pathogens. Each
well was filled with 20 µL of reconstituted supernatant, respectively. In parallel, blank growth
medium with no organism was evaporated, reconstituted, and loaded in a well within each
respective plate. The latter were incubated at 37ºC

Hasil (Bahasa Indonesia) 1:

ABSTRAK
tujuan: untuk mengidentifikasi novel antibiotik yang menghasilkan strain mikroba dengan belum pernah terjadi sebelumnya
kebenaran. Kami berhipotesis bahwa contoh spesifik lokasi tanah akan berisi berbagai spesies antibioticproducing (APS) dengan beragam kekhususan dari molekul elemen.
tempat dan durasi studi: Laboratorium mikrobiologi, Divisi biologis dan kesehatan
Sciences, University of Pittsburgh, Bradford, Bearing, USA, antara Agustus 2010 dan
Mei 2011.
metodologi: sampel tanah lingkungan dikumpulkan dari perumahan dan
rekreasi situs di Selatan, PA, Amerika Serikat di bujur:-76 42 21.7116, lintang: 39 56
35.7252; sekitar 201 meter di atas permukaan laut. Lebih dari 70 alam antibiotik memproduksi
bakteri tanah diputar melawan mikroorganisme patogen 19. Agar-plug assay adalah
didirikan untuk mengidentifikasi potensi antibiotik dan perhitungan indeks penghambatan patogen
dipekerjakan untuk mengukur potensi penghambatan isolat masing-masing; 16S rRNA Sekuensing
digunakan untuk klasifikasi mikroba.
hasil: total 71 mikroorganisme dari tanah perumahan menunjukkan zona inhibition
(ZOI), diikuti oleh organisme 9 dari sampel tanah rekreasi. Total 15 bioaktif strain
menunjukkan meyakinkan pertumbuhan properti penghambatan terhadap 16 secara klinis relevan
patogen; 40% mengungkapkan kehadiran pDNA, yang 67% dipamerkan ketat potensi
terhadap S. aureus. Kami mengamati mikrobiota tanah residensial yang sangat bioactive dibandingkan
rekreasi tanah.
kesimpulan: 16S rRNA urutan analisis diperkuat beberapa spesies milik
Enterobacteriaceae, Xanthomonadaceae dan Bacillaceae. Temuan ini dapat menunjukkan
biosintesis co-evolusi novel antibiotik yang didorong oleh peningkatan bioaktif
mikrobiota di lingkungan perumahan.
kata kunci: 16S rRNA; antibiotik; mikroorganisme; antibiotik potensi; zona hambat;
patogen; antibiotik perlawanan.
1. PENGENALAN
Produk mikroba sekunder metabolisme melakukan peran penting dalam kesehatan manusia,
memberikan peta jalan untuk biosintesis banyak obat sintetis dan semi sintetis. Di
alam, produk mikroba bioaktif hadir sebagai mycotoxins atau bacteriosins berasal dari
berserabut dan bebas-berserabut bakteri dan jamur. Tanah berbasis aktinomycetes memiliki
menjadi sumber obat-obatan yang tak terhitung jumlahnya, dari Streptomisin dan actinomycin, untuk Eritromisin dan
Vankomisin [1]. Alam tanah pelabuhan mikroorganisme lebih dari 109 / gram dan menyediakan ideal
reservoir untuk mikrobiota bioaktif, yang muncul hampir semua antibiotik klinis yang digunakan hari ini
[2,3]. Hari ini hampir 500 antibiotik yang ditemukan setiap tahun dan lebih dari 80% dari antibiotik dalam klinis
penggunaan yang Diperoleh dari tanah isolat [1]. Mikroorganisme ini bioaktif yang paling berlimpah
hadir di atas beberapa inci tanah, di tanah yang mengandung jerami dan pertanian Produk
[2,4]. Studi juga menyarankan bahwa tanah dari daerah yang mengandung perumahan yang diturunkan
bahan, seperti manusia tinja, mengandung strain 10 - 20 kali lebih resisten antibiotik
daripada rekreasi atau industri tanah [5]. Akibatnya dan menggunakan ditinggikan dari
terapi obat di lingkungan perkotaan atau perumahan, perumahan tanah mengandung sangat
tinggi bioactivity dan yang berlimpah waduk resisten antibiotik mikroorganisme [5,6].
Plasmid-dimediasi antibiotik memproduksi gen dapat diperoleh lingkungan oleh
transposisi dari mikroorganisme satu untuk lain [2]. Fenomena intraseluler
akuisisi plasmid memungkinkan memproduksi antibiotik bakteri untuk hidup berdampingan dengan resisten antibiotik
strain melalui sintesis novel senyawa bioaktif, yang memungkinkan mereka untuk memerangi
terus berkembang resisten terhadap antibiotik rekan-rekan mereka [7,8]. Adaptasi coevolutionary canggih ini abadi dalam tanah mikroba-kaya dan mewakili besar
Reservoir untuk novel, alam antibiotik (non-disintesis). Kemajuan sukses
aplikasi terapi antibiotik non sintetis dan sintetis karena itu memerlukan konstan
identifikasi dan karakterisasi alami memproduksi antibiotik mikroorganisme.
karena ketidaknyamanan mereka topografi, penelitian kecil telah benar-benar dilakukan pada
microenvironments perumahan. Kami bertujuan untuk mengeksplorasi biosintesis antibiotik alami
potensi mikroorganisme yang terisolasi dari tanah yang dikumpulkan di situs tempat tinggal dan rekreasional
dan hipotesis bahwa contoh spesifik lokasi tanah akan mengandung keragaman galur antibioticproducing (APS) dengan berbagai elemen molekul. Karakterisasi molekul
beberapa spesies penghambatan pertumbuhan terisolasi mengungkapkan plasmid kehadiran DNA (pDNA).
Kami mengamati memproduksi antibiotik komunitas yang lebih tinggi di tanah perumahan dibandingkan
rekreasi tanah. Beragam populasi mikroba, sekitar 105 mikroorganisme per
gram tanah, ditampilkan jumlah berlebihan tinggal di tanah APS terhadap 16 secara klinis relevan
patogen; 16S rRNA Sekuensing mengungkapkan sifat-sifat unik heterogenitas di APS ini
2. METODE dan bahan
2.1 strain isolasi
sampel tanah lingkungan dikumpulkan di Selatan, PA, Amerika Serikat dari 2010-2011 di
bujur:-76 42 21.7116, lintang: 39 35.7252 56, sekitar 201 meter di atas laut
tingkat. Dua utama lokasi yang dipilih untuk pengambilan sampel: area rekreasi dengan
tinggi lalu lintas manusia (i.e. 94 halaman situs industri) dan properti residensial resmi
dengan penduduk manusia yang ada. Sampel dikumpulkan ditempatkan di polietilena tas dan
disimpan dalam gelap di 4
0
C sampai dianalisis untuk sifat antimikroba. Jenis tanah yang diperoleh di
kedua lokasi adalah tanah MT. Airy-Glenelg-Linganore (PA087; soilmap.psu.edu).
Due sifat heterogen sampel tanah, tiga berbeda pertumbuhan media, kedelai Tryptic
Agar (TSA), kentang dekstrosa Agar (PDA), dan gizi Agar (NA), digunakan untuk
munculnya dan isolasi mikroorganisme. Antibiotik yang menghasilkan kemampuan
mikrobiota dikumpulkan diuji di triplicates dan diuji oleh pertumbuhan zona hambat terhadap
19 mikroorganisme patogen secara klinis relevan Diperoleh dari jenis budaya Amerika
Koleksi (ATCC): Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus
thermophilus, Listeria monocytogenes, Ochrobae antropik, Staphylococcus sciuri, Kocuria
kristinae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterococcus saccharolyticus, Klebsiella
oxytoca, Streptococcus zooepidemicus, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Serratia
marcescens, Saccharomyces cerevisiae, Micrococcus luteus, Bacillus cereus, dan
Pseudomonas fluorescens.
2.2 primer dan sekunder penyaringan
semua mikroorganisme patogen yang tersebar pada 90-mm piring petri polystyrene dipenuhi
TSA, PDA dan NA media, masing-masing. Sampel mengumpulkan bioaktif tanah (1-5g) dari
masing-masing 112 dikeringkan di 37ºC dan ditaburi (~ 80-100 partikel) pada hidangan menyebar
dengan patogen ATCC masing-masing masing-masing. Kontrol piring hanya tersebar dengan ATCC
patogen dan burung di 37ºC. Setelah periode inkubasi 48 h, mikroorganisme yang menampilkan
jelas zona hambat terhadap patogen yang diasingkan ke piring dari masing-masing
menengah dan ditugaskan nomor. Diulang melesat dimurnikan mikroorganisme terisolasi
dan satu-sel koloni dijemput untuk pemeriksaan lebih lanjut dan penyimpanan sementara di 4ºC di
media-agar-penuh miring. Mikroorganisme yang menampilkan sedikit atau tidak ada patogen penghambatan
properti diuji ulang dan dibuang jika langka antibiotik biosintesis bertahan. Dimurnikan
mikroorganisme yang Diperoleh dari pemeriksaan utama ini lebih lanjut diuji untuk sifat-sifat growthinhibitory dengan menggunakan metode tegak lurus salib-piring (PCPM) [9] terhadap semua 19
patogen mikroorganisme. Memproduksi antibiotik isolat tersebut dianggap sebagai salah satu
mikroorganisme yang menghambat pertumbuhan lain mikroba dalam nya strategis [10].
Piring diinkubasi di 37ºC dan dianalisis setelah interval waktu yang teratur (12 h 16 h, 24 h,
dan 32h) untuk zona inhibisi (ZOI) di persimpangan. Mikroorganisme yang menampilkan sedikit atau
properti penghambatan pertumbuhan tidak diuji ulang dan dibuang jika tidak mencukupi antibiotik
biosintesis bertahan. APS mengungkapkan zona penghambatan terhadap satu atau lebih patogen yang
lebih lanjut dimurnikan dan terawat pada agar miring di 4ºC di media pertumbuhan masing-masing. APS
yang ditanam di inkubator orbital shaker di 37ºC semalam di masing-masing cair budaya
menengah dan rescreened terhadap semua 19 ATCC mikroorganisme menggunakan PCPM sebagai
tersebut
2.1.1 antibiotik produksi assay
karena signifikansi industri yang potensial, kami bertujuan untuk melakukan penyidikan menyeluruh antibiotik
mensekresi kemampuan antara APSs disaring. Sekunder disaring APSs dan kosong
kontrol yang ditanam di 50 ml media pertumbuhan cair masing-masing (TSB, PDB dan NB) di
37ºC, 120 rpm untuk 24 h. sel adalah pelleted (OD600 2.2-2,5) oleh sentrifugasi di 22ºC,
10, 000g untuk 10 menit. Supernatant dikumpulkan dan menguap oleh aliran udara steril
inkubasi di 37ºC. Tepung supernatant disterilkan dan dilarutkan dalam 1 ml
masing-masing pertumbuhan menengah dan disimpan di - 20ºC sampai dianalisis untuk sifat antibiotik
melalui agar-agar-plug assay.
2.3 Assay Agar-Plug
assay Agar-plug diadopsi dari Bechard et al. [11] dengan bor 5-mm steril gabus yang digunakan
untuk plug sumur di piring masing-masing agar (NA, PDA dan TSA) lawned dengan patogen. Setiap
juga dipenuhi dengan 20 μL dari dilarutkan supernatant, masing-masing. Secara paralel, kosong pertumbuhan
menengah dengan organisme tidak menguap, dilarutkan, dan dimuat dalam sebuah sumur dalam masing-masing
piring masing-masing. Yang terakhir adalah burung di 37ºC

Hasil (Bahasa Indonesia) 2:

ABSTRAK
Tujuan: Untuk mengidentifikasi baru strain mikroba antibiotik memproduksi dengan belum pernah terjadi sebelumnya
ketepatan. Kami berhipotesis bahwa sampel tanah spesifik lokasi akan berisi berbagai spesies antibioticproducing (APS) dengan beragam spesifisitas elemen molekul.
Tempat dan Lama Studi: Laboratorium Mikrobiologi, Divisi Biologi dan Kesehatan
Sciences, University of Pittsburgh, Bradford, PA- 16701, USA, antara Agustus 2010 dan
Mei 2011.
Metodologi: Sampel tanah lingkungan dikumpulkan dari perumahan dan
situs rekreasi di Southern, PA, USA pada bujur: -76 42 21,7116, latitude: 39 56
35,7252; sekitar 201 meter di atas permukaan laut. Lebih dari 70 antibiotik alami yang memproduksi
bakteri tanah yang disaring terhadap 19 mikroorganisme patogen. Agar-plug assay
didirikan untuk mengidentifikasi potensi antibiotik dan perhitungan indeks penghambatan patogen
yang digunakan untuk mengukur potensi penghambatan setiap isolat; 16S rRNA sequencing
digunakan untuk klasifikasi mikroba.
Hasil: Sebanyak 71 mikroorganisme dari tanah perumahan menunjukkan zona inhibisi
(Zoi), diikuti oleh 9 organisme dari sampel tanah rekreasi. Sebanyak 15 strain bioaktif
menunjukkan pertumbuhan sifat penghambatan meyakinkan terhadap 16 klinis relevan
patogen; 40% pDNA mengungkapkan kehadiran, dimana 67% dipamerkan potensi ketat
terhadap S. aureus. Kami mengamati mikrobiota tanah perumahan yang sangat bioaktif dibandingkan dengan
tanah rekreasi.
Kesimpulan: analisis urutan 16S rRNA menguatkan beberapa spesies yang termasuk
ke Enterobacteriaceae, Xanthomonadaceae, dan Bacillaceae. Temuan ini mungkin menunjukkan
sebuah biosintesis co-evolusi antibiotik baru didorong oleh peningkatan bioaktif
mikrobiota di lingkungan perumahan.
Keywords: 16S rRNA; antibiotik; mikroorganisme; potensi antibiotik; zona hambatan;
patogen; resistensi antibiotik.
1. PENDAHULUAN
Produk mikroba metabolisme sekunder membawa peran penting dalam kesehatan manusia,
menyediakan peta jalan untuk biosintesis banyak obat sintetis dan semi-sintetis. Di
alam, produk bioaktif mikroba yang hadir sebagai mikotoksin atau bacteriosins berasal dari
bakteri berserabut dan non-filamen dan jamur. The actinomycetes berbasis tanah telah
menjadi sumber obat-obatan yang tak terhitung jumlahnya, dari streptomisin dan actinomycin, terhadap eritromisin dan
vankomisin [1]. Pelabuhan tanah alami lebih dari 109 mikroorganisme / gram dan menyediakan ideal
reservoir untuk mikrobiota bioaktif, yang mata air hampir semua antibiotik klinis digunakan saat ini
[2,3]. Hari ini hampir 500 antibiotik ditemukan setiap tahun dan lebih dari 80% dari antibiotik dalam klinis
digunakan diperoleh dari tanah isolat [1]. Mikroorganisme bioaktif yang paling berlimpah
hadir di beberapa inci atas tanah, di tanah yang mengandung jerami dan produk pertanian
[2,4]. Studi juga menunjukkan bahwa tanah dari daerah yang mengandung perumahan yang diturunkan
bahan seperti kotoran manusia, mengandung 10-20 kali lebih banyak strain resisten antibiotik
dari tanah rekreasi atau industri [5]. Akibatnya dan di samping penggunaan peningkatan
obat terapi di lingkungan perkotaan atau perumahan, tanah perumahan mengandung sangat
bioaktivitas tinggi dan waduk berlimpah mikroorganisme resisten antibiotik [5,6].
Plasmid-dimediasi gen yang memproduksi antibiotik dapat diperoleh lingkungan dengan
transposisi dari satu mikroorganisme yang lain [2]. Fenomena intraseluler
akuisisi plasmid memungkinkan bakteri-antibiotik untuk memproduksi berdampingan dengan resisten antibiotik
strain melalui sintesis senyawa bioaktif baru, yang memungkinkan mereka untuk memerangi
antibiotik rekan-rekan mereka terus berkembang tahan [7,8]. Adaptasi coevolutionary canggih ini abadi dalam tanah kaya mikroba dan merupakan besar
waduk untuk novel, alami (non-disintesis) antibiotik. Kemajuan sukses
aplikasi terapi non-sintetis dan sintetis antibiotik karena itu memerlukan konstan
identifikasi dan karakterisasi mikroorganisme antibiotik alami memproduksi.
Karena ketidaknyamanan topografi mereka, sedikit penelitian telah dilakukan secara menyeluruh di
lingkungan mikro perumahan. Kami bertujuan untuk mengeksplorasi biosintesis antibiotik alami
potensi mikroorganisme diisolasi dari tanah yang dikumpulkan di lokasi perumahan dan rekreasi
dan hipotesis bahwa sampel tanah spesifik lokasi akan berisi keragaman antibioticproducing strain (APS) dengan berbagai elemen molekul. Karakterisasi molekuler
dari beberapa spesies pertumbuhan hambat terisolasi mengungkapkan plasmid DNA (pDNA) kehadiran.
Kami mengamati komunitas antibiotik memproduksi lebih tinggi dalam tanah perumahan dibandingkan dengan
tanah rekreasi. Populasi mikroba yang beragam, sekitar 105 mikroorganisme per
gram tanah, ditampilkan jumlah berlebihan APS tanah-sarang terhadap 16 klinis relevan
patogen; 16S rRNA sequencing mengungkapkan ciri-ciri heterogenitas yang unik di APS ini
2. BAHAN DAN METODE
2.1 Strain Isolasi
sampel tanah Lingkungan dikumpulkan di Southern, PA, USA 2010-2011 di
bujur: -76 42 21,7116, latitude: 39 56 35,7252, sekitar 201 meter di atas permukaan laut
tingkat. Dua lokasi utama yang dipilih untuk pengumpulan sampel: area rekreasi dengan
lalu lintas manusia yang tinggi (yaitu 94 meter dari kawasan industri) dan properti perumahan yang berwenang
dengan penduduk manusia ada. Sampel yang dikumpulkan ditempatkan dalam kantong polietilen dan
disimpan dalam gelap pada 4
0
C sampai dianalisis untuk sifat antimikroba. Jenis tanah yang diperoleh di
kedua lokasi adalah MT. Airy-Glenelg-Linganore tanah. (PA087; soilmap.psu.edu)
Karena sifat heterogen dari sampel tanah, media yang berbeda pertumbuhan tiga, Tryptic Soy
Agar (TSA), Potato Dextrose Agar (PDA), dan Nutrient Agar (NA) , dipergunakan untuk
munculnya dan isolasi mikroorganisme. Kemampuan antibiotik memproduksi dari
mikrobiota yang terkumpul diuji dalam tiga ulangan dan diuji dengan zona hambatan pertumbuhan terhadap
19 mikroorganisme patogen klinis yang relevan yang diperoleh dari American Type Culture
Collection (ATCC): Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus
thermophilus, Listeria monocytogenes, Ochrobae antropis, Staphylococcus sciuri, Kocuria
kristinae, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterococcus saccharolyticus, Klebsiella
oxytoca, Streptococcus zooepidemicus, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Serratia
marcescens, Saccharomyces cerevisiae, Micrococcus luteus, Bacillus cereus, dan
Pseudomonas fluorescens.
2.2 Skrining Primer dan Sekunder
Semua patogen mikroorganisme yang tersebar di 90-mm piring polistiren petri diisi dengan
TSA, PDA, dan menengah NA, masing-masing. Sampel yang dikumpulkan bioaktif tanah (1-5g) dari
masing-masing 112 lokasi dikeringkan pada 37 º C dan ditaburi (~ 80-100 partikel) pada hidangan yang tersebar
satu sama ATCC patogen masing. Kontrol piring hanya menyebar dengan ATCC
patogen dan diinkubasi pada suhu 37 º C. Setelah masa inkubasi 48 jam, mikroorganisme menampilkan
zona yang jelas dari penghambatan terhadap patogen yang diasingkan ke piring masing-masing
nomor yang ditetapkan menengah dan besar. Diulang melesat dimurnikan mikroorganisme terisolasi
dan koloni-sel tunggal dijemput untuk skrining lebih lanjut dan penyimpanan sementara pada 4 º C di
media-agar penuh miring. Mikroorganisme menampilkan sedikit atau tidak ada penghambatan patogen
sifat diuji ulang dan dibuang jika biosintesis antibiotik langka bertahan. Dimurnikan
mikroorganisme yang diperoleh dari skrining utama ini selanjutnya diuji untuk sifat growthinhibitory dengan menggunakan metode cross-plate tegak lurus (PCPM) [9] terhadap semua 19
mikroorganisme patogen. Isolat antibiotik memproduksi dianggap sebagai salah
mikroorganisme yang menghambat pertumbuhan mikroba lain dalam batas-batas nya [10].
Pelat diinkubasi pada suhu 37 º C dan dianalisis setelah interval waktu yang teratur (12 jam, 16 jam, 24 jam,
dan 32h) untuk zona inhibisi (Zoi) di persimpangan. Mikroorganisme menampilkan sedikit atau
tidak ada pertumbuhan sifat penghambatan diuji ulang dan dibuang jika antibiotik tidak cukup
biosintesis bertahan. APS mengungkapkan zona penghambatan terhadap satu atau lebih patogen yang
dimurnikan lebih lanjut dan dipelihara pada agar miring pada 4 º C dalam medium pertumbuhan masing-masing. APS
ditumbuhkan dalam inkubator pengocok orbital pada 37 º C semalam di kultur cair masing-masing
media dan rescreened terhadap semua 19 ATCC mikroorganisme menggunakan PCPM sebagai
tersebut
assay 2.1.1 produksi Antibiotik
Karena potensi signifikansi industri mereka, kami bertujuan untuk menyelidiki antibiotik
kemampuan mensekresi antara disaring APSS. Sekunder disaring APSS dan kosong
kontrol ditumbuhkan dalam 50 ml medium pertumbuhan cair masing-masing (TSB, PDB, dan NB) pada
37 º C, 120 rpm selama 24 jam. Sel pellet (OD600 2,2-2,5) dengan sentrifugasi pada 22 º C,
10.000 g selama 10 menit. Supernatan dikumpulkan dan diuapkan oleh aliran udara steril
inkubasi pada 37 º C. Supernatan kering itu disterilkan dan dilarutkan dalam 1 ml
medium pertumbuhan masing-masing dan disimpan pada suhu -20 º C sampai dianalisis untuk sifat antibiotik
melalui agar-plug assay.
2.3 Agar-Plug Assay
Agar-plug assay diadopsi dari Bechard et al. [11] dengan 5-mm gabus steril penggerek digunakan
untuk plug sumur di masing-masing piring agar (NA, PDA, dan TSA) lawned dengan patogen. Setiap
sumur diisi dengan 20 uL supernatan dilarutkan, masing-masing. Secara paralel, pertumbuhan kosong
media dengan tidak ada organisme diuapkan dilarutkan, dan dimuat di sebuah sumur dalam setiap
piring masing-masing. Yang terakhir diinkubasi pada suhu 37 º C