Because chymotrypsin can also catal

Because chymotrypsin can also catalyze the hydrolysis of esters and amides, p-nitrophenolacetate was used in conjunction with chymotrypsin. The reaction with p-nitrophenolacetate will yield p-nitrophenol, a chromic-effector with a yellow color change in the product. The absorbency can be determined from the color and the intensity can determine the amount of product. Hartley and Kilby used this information in 1954 to show that the reaction proceeds in two phases: a Burst Phase and then levels off to a steady-state phase. Thus, there is a formation of a covalently bound enzyme substrate intermediate.

N-Acetyl-L-phenylalanine p-nitrophenyl ester yields a yellow product, p-Nitrophenolate, on cleavage by chymotrypsin.
Another test to determine the mechanism of chymotrypsin hydrolysis was to treat the protease with an organofluorophosphate, diisopropylphosphofluoridate (DIPF). In this reaction, chymotrypsin loses all activity and becomes inactivated. Since only serine-195 was modified by diisopropylphosphofluoridate, it indicates that Serine-195 plays the crucial role in the mechanism as a nucleophile. It is covalently linked to Serine-195. Covalent catalysis of chymotrypsin basically goes through acylation and deacylation. Acylation forms the acyl enzyme intermediate and the deacylation adds water which produces a free enzyme.
Site-directed mutagenesis is another technique that can test the reaction by creating a mutant in the amino acid sequence of the active site of the enzyme. It supported the mechanism below by demonstrating that the replacement through site directed mutagenesis of any one member of the catalytic triad had a devastating effect on reaction rate. In fact, replacing just one of the triad had the same effect as replacing all three--demonstrating that each component is vital for efficient catalysis. While the enzyme continued to bind to the substrate (we know this because the KM remained constant throughout the replacements--it required the same substrate concentration to achieve half of the maximum rate), the reaction rate was orders of magnitude smaller without the triad.

Hasil (Bahasa Indonesia) 2:

Karena kimotripsin juga dapat mengkatalisis hidrolisis ester dan amida, p-nitrophenolacetate digunakan dalam hubungannya dengan chymotrypsin. Reaksi dengan p-nitrophenolacetate akan menghasilkan p-nitrofenol, sebuah kromat-efektor dengan perubahan warna kuning pada produk. Serap dapat ditentukan dari warna dan intensitas yang dapat menentukan jumlah produk. Hartley dan Kilby menggunakan informasi ini pada tahun 1954 untuk menunjukkan bahwa hasil reaksi dalam dua tahap: Tahap Burst dan kemudian tingkat off untuk fase mapan. Dengan demikian, ada pembentukan substrat enzim kovalen terikat menengah. N-Acetyl-L-fenilalanin p-nitrofenil ester menghasilkan produk kuning, p-Nitrophenolate, pada pembelahan oleh chymotrypsin. Tes lain untuk menentukan mekanisme kimotripsin hidrolisis adalah untuk mengobati protease dengan organofluorophosphate, diisopropylphosphofluoridate (DIPF). Dalam reaksi ini, kimotripsin kehilangan semua aktivitas dan menjadi tidak aktif. Karena hanya serin-195 dimodifikasi oleh diisopropylphosphofluoridate, ini menunjukkan bahwa Serin-195 memainkan peran penting dalam mekanisme sebagai nukleofil. Hal ini kovalen terkait dengan Serin-195. Kovalen katalisis kimotripsin pada dasarnya berjalan melalui asilasi dan deacylation. Asilasi membentuk asil yang enzim intermediate dan deacylation menambahkan air yang menghasilkan enzim bebas. Situs-diarahkan mutagenesis adalah teknik lain yang dapat menguji reaksi dengan menciptakan mutan dalam urutan asam amino dari situs aktif enzim. Ini didukung mekanisme bawah dengan menunjukkan bahwa penggantian melalui mutagenesis terarah dari salah satu anggota triad catalytic memiliki dampak buruk terhadap laju reaksi. Bahkan, menggantikan salah satu triad memiliki efek yang sama seperti mengganti ketiga - yang menunjukkan bahwa setiap komponen penting untuk katalisis efisien. Sementara enzim terus mengikat substrat (kita tahu ini karena KM tetap konstan sepanjang pengganti - itu diperlukan konsentrasi substrat yang sama untuk mencapai setengah dari tarif maksimum), laju reaksi adalah lipat lebih kecil tanpa tiga serangkai.