Construction of Expression Vectors—

Construction of Expression Vectors—BEK cDNA clone A8 (5) was used as the template for expression vector construction. To generate the heavy chain-containing HL-BEK construct, an XhoI site was created at nucleotide 701 (before the first low density lipoprotein receptor-like domain) by PCR with primers 59-gat atc aca gga aac tag tct cac tcga gtg ccc acc tg-39 (SpeI and XhoI sites are underlined) and 59-cgt ctt cct cct ggt cca gtt g-39 (complement of nucleotides 1350–1371 of BEK). The PCR product was digested with SpeI and BstXI; BEK clone A8 was digested with SpeI and partially digested with BstXI and then ligated to the PCR fragment to generate pBlue-HL. The desired fragment of pBlue-HL was isolated by digestion with XhoI and HindIII and then ligated to SalI/HindIII-digested His6 vector pET-28b(1) (Novagen, Madison, WI) to generate plasmid pET-28bHL. Human prothrombin signal peptide sequence was amplified by PCR using plasmid pDPT (13) as template and primers 59-gga att ccc cat gga agc ttg aat tcc cag gag ctg aca c-39 (adjacent NcoI and HindIII sites underlined) and 59-gat cga tct cat gac act tgt ggc ggt gaa tg-39 (BspHI site underlined). The product was digested with NcoI and BspHI and ligated to NcoIlinearized pET-28bHL to generate plasmid pET-28bHL/Nco, which contains the prothrombin signal peptide, the His6 tag, and HL-BEK cDNA. This insert was removed by digestion with HindIII, made blunt, and ligated to SmaI-digested pNUT (14) to produce the expression plasmid pNUTHL. Plasmid pNUTL, encoding L-BEK lacking the enteropeptidase heavy chain, was constructed similarly except that an XhoI site was introduced at nucleotide 2453 in the first step by PCR with primers 59-aat agc tct aga ctc gag agt aac tac aaa tca tgt ggg-39 (adjacent XbaI
and XhoI sites underlined) and 59-aaa ggc att aca ata aat ag-39 (complement of nucleotides 2998–3017 of BEK). The PCR product was digested with XbaI and NsiI and ligated in place of the corresponding fragment of the parent template to generate plasmid pBlue-L. For all plasmids, the segments derived by PCR were sequenced to confirm the accuracy of the construction.

Hasil (Bahasa Indonesia) 1:

Pembangunan ekspresi vektor — BEK cDNA klon A8 (5) digunakan sebagai template untuk ekspresi vektor konstruksi. Untuk menghasilkan berat yang mengandung jaringan HL-BEK membangun, XhoI situs ini dibuat di nukleotida 701 (sebelum pertama reseptor-seperti lipoprotein densitas rendah domain) oleh PCR dengan primers 59-gat atc aca gga aac tag tct cac tcga gtg ccc acc tg-39 (SpeI dan XhoI situs yang digarisbawahi) dan 59-cgt ctt cct cct ggt cca gtt g-39 (pelengkap nukleotida 1350 – 1371 dari BEK). PCR produk dicerna dengan SpeI dan BstXI; BEK klon A8 dicerna dengan SpeI dan sebagian dicerna dengan BstXI dan kemudian ligated untuk fragmen PCR untuk menghasilkan pBlue-HL. Fragmen diinginkan pBlue-HL terisolasi oleh pencernaan dengan XhoI dan HindIII dan kemudian ligated untuk His6 SalI/HindIII-dicerna vektor pET-28b(1) (Novagen, Madison, WI) untuk menghasilkan plasmid pET-28bHL. Manusia prothrombin sinyal peptida urutan ini diperkuat oleh PCR menggunakan plasmid pDPT (13) sebagai template dan primers 59-gga att ccc kucing gga agc ttg aat tcc cag gag ctg aca c-39 (berdekatan NcoI dan HindIII situs digarisbawahi) dan 59-gat cga tct kucing gac bertindak tgt ggc ggt gaa tg-39 (BspHI situs yang digarisbawahi). Produk dicerna dengan NcoI dan BspHI dan ligated untuk NcoIlinearized hewan peliharaan-28bHL untuk menghasilkan plasmid pET-28bHL/bintara, yang berisi prothrombin sinyal peptida, His6 tag dan HL-BEK cDNA. Menyisipkan ini dihapus oleh pencernaan dengan HindIII, membuat tumpul, dan ligated untuk dicerna SmaI pNUT (14) untuk menghasilkan ekspresi plasmid pNUTHL. PNUTL plasmid, pengkodean kurang rantai berat enteropeptidase, L-BEK dibangun sama kecuali bahwa situs XhoI diperkenalkan di nukleotida 2453 pada langkah pertama oleh PCR dengan primers 59-aat agc tct aga ctc gag agt aac tac aaa tca tgt ggg-39 (XbaI berdekatanand XhoI sites underlined) and 59-aaa ggc att aca ata aat ag-39 (complement of nucleotides 2998–3017 of BEK). The PCR product was digested with XbaI and NsiI and ligated in place of the corresponding fragment of the parent template to generate plasmid pBlue-L. For all plasmids, the segments derived by PCR were sequenced to confirm the accuracy of the construction.

Hasil (Bahasa Indonesia) 2:

Pembangunan Ekspresi Vektor-BEK cDNA clone A8 (5) digunakan sebagai template untuk konstruksi vektor ekspresi. Untuk menghasilkan rantai berat yang mengandung HL-BEK membangun, situs XhoI diciptakan pada nukleotida 701 (sebelum domain reseptor-seperti kepadatan rendah lipoprotein pertama) dengan PCR dengan primer 59-gat atc aca gga aac tag TCT cac tcga GTG ccc acc tg-39 (situs SPEI dan XhoI yang digarisbawahi) dan 59-cgt ctt CCT CCT ggt cca tetes g-39 (komplemen dari nukleotida 1.350-1.371 dari BEK). Produk PCR dicerna dengan SPEI dan BstXI; BEK clone A8 itu dicerna dengan SPEI dan dicerna sebagian dengan BstXI dan kemudian diikat ke fragmen PCR untuk menghasilkan pBlue-HL. Fragmen yang diinginkan dari pBlue-HL diisolasi oleh pencernaan dengan XhoI dan HindIII dan kemudian diikat ke SalI / HindIII-dicerna Ilis6 vektor pET-28b (1) (Novagen, Madison, WI) untuk menghasilkan plasmid pET-28bHL. Manusia protrombin urutan sinyal peptida diamplifikasi dengan PCR menggunakan plasmid PDPT (13) sebagai template dan primer 59-gga att ccc kucing gga AGC ttg aat TCC cag gag ctg aca c-39 (yang berdekatan situs NcoI dan HindIII digarisbawahi) dan 59-gat CGA TCT kucing GAC tindakan tgt GGC ggt gaa tg-39 (situs BspHI digarisbawahi). Produk tersebut dicerna dengan NcoI dan BspHI dan diikat ke NcoIlinearized pET-28bHL untuk menghasilkan plasmid pET-28bHL / bintara, yang berisi peptida sinyal protrombin, tag Ilis6, dan HL-BEK cDNA. Insert ini telah dihapus oleh pencernaan dengan HindIII, dibuat tumpul, dan diikat ke SmaI-dicerna pNUT (14) untuk menghasilkan ekspresi plasmid pNUTHL. Plasmid pNUTL, encoding L-BEK kurang rantai berat enteropeptidase, dibangun sama kecuali bahwa situs XhoI diperkenalkan pada nukleotida 2453 pada langkah pertama dengan PCR dengan primer 59-aat AGC TCT aga CTC gag AGT aac tac aaa TCA tgt ggg- 39 (XbaI yang berdekatan
dan situs XhoI digarisbawahi) dan 59-aaa GGC att aca ata aat ag-39 (komplemen dari nukleotida 2.998-3.017 dari BEK). Produk PCR dicerna dengan XbaI dan NsiI dan diikat di tempat fragmen sesuai template induk untuk menghasilkan plasmid pBlue-L. Untuk semua plasmid, segmen yang diperoleh PCR yang sequencing untuk mengkonfirmasi keakuratan konstruksi.