2.1.1 Antibiotic production assayDu

2.1.1 Antibiotic production assay
Due to their potential industrial significance, we aimed to thoroughly investigate antibiotic
secreting abilities among the screened APSs. Secondarily screened APSs and blank
controls were grown in 50 ml of respective liquid growth medium (TSB, PDB, and NB) at
37ºC, 120 rpm for 24 h. Cells were pelleted (OD600 2.2-2.5) by centrifugation at 22ºC,
10,000g for 10 min. The supernatant was collected and evaporated by sterile airflow
incubation at 37ºC. Desiccated supernatant was sterilized and reconstituted in 1 ml
respective growth medium and stored at -20ºC until analyzed for antibiotic properties
through agar-plug assay.
2.3 Agar-Plug Assay
Agar-plug assay was adopted from Bechard et al. [11] with a 5-mm sterile cork borer utilized
to plug wells on respective agar plates (NA, PDA, and TSA) lawned with pathogens. Each
well was filled with 20 µL of reconstituted supernatant, respectively. In parallel, blank growth
medium with no organism was evaporated, reconstituted, and loaded in a well within each
respective plate. The latter were incubated at 37ºC and examined for ZOI, a clear halo
around the wells, after regular time intervals (12 h, 16 h, 24 h, and 32 h). Isolates displaying
remarkable inhibitory properties were kept for further analysis. APS with little inhibitory
properties were retested at 30 µL and 40 µL per well and discarded if insufficient antibiotic
biosynthesis persisted. We utilized photographic pixel quantification (Adobe Photoshop CS6)
to distinguish which isolates developed the most unpenetrated inhibitory perimeters [12]. The
difference in pixel density between the streaked plates and its ZOI area was calculated and
used to assign an inhibitory potency value ranging from 0-5 to each isolate; the sum of these
values determined the Antibiotic Potency (A.P). The latter, along with ZOI diameter
measurements and the range of pathogenic inhibition (i.e. number of pathogens inhibited),
was used to calculate the Pathogenic Inhibitory Index (P.I.I) of each isolate, providing a
holistic view isolates’ growth inhibition potentials:
2.4 Plasmid DNA Extraction
The screened APSs were characterized for the presence of pDNA. pDNA was isolated from
overnight grown APSs (OD600 2.2-2.5) using PureLink
TM
Quick Plasmid Miniprep kit
(Invitrogen, USA). The isolated pDNA was visualized on 1% (w/v) agarose gel
electrophoresis stained with ethidium bromide.
2.5 Phylogenetic Analysis
Cellular DNA from three APSs: Y14p, Y16 and Y40p, which shared analogous morphologies
and growth inhibitory properties as most soil isolates, was extracted using PureLink™
Genomic DNA MiniKit K1820-01 (Invitrogen, USA). The 16S rRNA gene sequences from
these three APSs were then amplified using universal primer (F-518:
CCAGCAGCCGCGGTAATACG, R-800: TACCAGGGTATCTAATCC) and sequenced at
Macrogen Service Center (Rockville, MD, USA). All sequences were compared with closest
relatives from GenBank and Ribosomal Database Project (RDP) release 10
(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp). Phylogenetic trees were constructed by neighbor-joining
method (NJ) with pairwise deletion of gaps in RDP database.
2.5.1 Nucleotide sequence accession numbers
The sequences of all pure cultures have been deposited in GenBank database under
accession numbers JQ956432, JQ956433, and JX121858 for Y14, Y16, and Y40,
respectively.
2.6 Statistical Analysis
All experiments were carried out in triplicate, and the experimental results represent the
mean of three identical sets of experiments. One-way ANOVAs followed by least significant
difference (Tukey’s honestly significant difference) were performed to evaluate the potential
significant differences.
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1 Isolation of Antibiotic-Producing Microorganisms
The primary screening of residential and recreational soils yielded a total of 71 and 9
promising APS with growth inhibitory properties, respectively
Table 1. Count of residential and recreational soil isolates displaying antibioticproducing capacities at different screening stages
All isolates selected from primary screening were re-screened by PCPM. Most isolates
obtained from recreational sites showed insufficient inhibitory capacities against all nineteen
pathogenic microorganisms during secondary screening. Only one isolate (L59) from
recreational sites insistently exhibited growth inhibitory properties, inhibiting B. cereus, C.
albicans, P. fluorescence, S. aureus, and S. zooepidemicus on NA medium (Table 2). The
broad range of isolates from residential soil samples, i.e. 11 (21.2%), 4 (33.3%), and 4
(57.5%) isolates, displayed sufficient growth inhibitory properties on NA, PDA, and TSA
media, respectively (Table 1). Recreational soil did not reveal isolates with growth inhibitory
properties on TSA or PDA medium, and overall yielded nearly six times less APS than
residential soil (Table 1, P = .05).
Table 2. Soil isolates displaying robust growth inhibitory properties after secondary
screenings by cross-plate assay against 19 pathogens on three different media
ATCC
Pathogens
Gram
staining
PDA NA TSA.
The single remaining recreational soil-derived isolate (L59) persisted through this screening. Overall, a
total of 15 different antibiotic-producing isolates with sufficient inhibitory potential were
isolated and further characterized. The single remaining recreational soil-derived isolate
(L59) persisted through this screening. Overall, a total of 15 different antibiotic-producing
organisms with sufficient inhibitory potential were isolated and further characterized. During
our study, isolates’ inhibitory capacities alternated at different screening stages. At some
stages they displayed growth suppressive abilities towards certain pathogens but lost or
switched these inhibitory abilities toward other pathogens during a different screening stage
(Table 1-2). These observations may indicate the presence of highly spontaneous antibioticspecificity swapping involved interdependently in antibiotic synthesis between soil isolates within an optimal microenvironment, and support previous studies which specify the robust
influence of neighboring microorganisms on surrounding bacterial antibiotic secretion [13].
3.2 Growth-Inhibitory Assessment
Individual values of average zone of inhibition (ZOI) of each isolate are summarized in Table
3, and reveal Y14 with the largest ZOI (10.16mm), demonstrated against pathogen K.
kristinae on PDA media. Isolate Y13 exhibited its maximum inhibitory perimeter against S.
marcescess (9.40mm). Y14p and Y44 displayed their maximum inhibitory perimeters against
K. kristinae (10.16mm and 2.01mm, respectively). Y16 and Y67p displayed their largest
inhibitory perimeters against L. monocytogenes (2.54mm and 2.54mm). Y16a revealed
maximum ZOI against O. anthropi (2.54mm). The isolate Y17p exhibited its maximum
inhibitory perimeter against P. fluorescence, C. albicans and S. aureus (2.54mm, 2.54 mm,
and 2.54 mm). Y29p displayed its largest inhibitory zone against P. fluorescence and S.
aureus (2.54mm and 2.54mm). Similarly, Y39 had its greatest inhibitory perimeter against
En. saccharolyticus (2.29mm). Y40p greatest inhibitory perimeter was against P.
fluorescence (2.54mm). The isolates Y49 and L59 maximum inhibitory perimeter was
against S. aureus (6.35 mm and 6.10 mm). Y63p largest ZOI was against S.
zooepiderimicus (3.81mm). Y64a maximum ZOI was against C. albicans (2.54mm). Y64b
largest ZOI was against L. monocytogenes (5.08 mm).
Furthermore, the APSs antibiotic potency (A.P) and average range of growth inhibition of
pathogenic microorganisms were determined. Isolates Y17p andY14p demonstrated the
greatest A.P, which was observed against P. fluorescence (A.P. = 5) and M. luteus (A.P. =
5), respectively. Y63p however had the widest range of pathogenic inhibition, revealing
growth suppressive capacities against more than 60% of the screened clinically-relevant
pathogens L. monocytogenes, En. saccharolyticus, K. kristinae, K. faecalis, M. luteus, O.
anthropi, S. cerevisiae, S. aureus, S. scuiri, and S. zooepiderimicus. Among the isolated
microorganisms, isolates Y14p, Y63p, and Y13 had the greatest P.I.I (i.e. 35.3, 26.1, and
25.3), respectively, as the combination of their range of pathogenic inhibition, A.P, and ZOI
was the greatest (Fig. 1a). Isolates Y44, and Y39 demonstrated the weakest A.P,
respectively. No isolate was able to inhibit K. pneumoniae, K. oxytoca, and S. thermophilus.
As anticipated, positive correlations existed between A.P, P.I.I (c.c=0.85, P = .05), ZOI
(c.c=0.92, P = .05), and the range of pathogens inhibition (Fig. 1d; c.c= 0.76; P = .05) (Fig. 1
b,c
Fig. 1. Mean pathogenic inhibitory index of soil isolates
A: Several soil isolates revealed elevated mean pathogenic index. B: Positive correlation displayed
between APS’ antibiotic potency and Pathogenic Inhibitory Index (Correlation coefficient=0.96, P =
.05). Mean (± S.E.M). C: Positive correlation demonstrated between antibiotic potency and zone of
inhibition measurement (c.c=0.84, p > 0.05). Mean (± S.E.M). D: Positive correlation displayed
between the range of pathogenic inhibition and the Pathogenic Inhibitory Index (c.c= -0.20, * P = .05)
3.3 Detection of Plasmid DNA
To determine the molecular elements which may be involved in antibiotic production in site
specific soil isolates, we looked for plasmid DNA existence and found it in several residential
soil-derived APSs, designated

Hasil (Bahasa Indonesia) 1:

2.1.1 antibiotik produksi assay
karena signifikansi industri yang potensial, kami bertujuan untuk melakukan penyidikan menyeluruh antibiotik
mensekresi kemampuan antara APSs disaring. Sekunder disaring APSs dan kosong
kontrol yang ditanam di 50 ml media pertumbuhan cair masing-masing (TSB, PDB dan NB) di
37ºC, 120 rpm untuk 24 h. sel adalah pelleted (OD600 2.2-2,5) oleh sentrifugasi di 22ºC,
10,000g untuk 10 menit. Supernatant dikumpulkan dan menguap oleh aliran udara steril
inkubasi di 37ºC. Tepung supernatant disterilkan dan dilarutkan dalam 1 ml
masing-masing pertumbuhan menengah dan disimpan di - 20ºC sampai dianalisis untuk sifat antibiotik
melalui agar-agar-plug assay.
2.3 Assay Agar-Plug
assay Agar-plug diadopsi dari Bechard et al. [11] dengan bor 5-mm steril gabus yang digunakan
untuk plug sumur di piring masing-masing agar (NA, PDA dan TSA) lawned dengan patogen. Setiap
juga dipenuhi dengan 20 μL dari dilarutkan supernatant, masing-masing. Secara paralel, kosong pertumbuhan
menengah dengan organisme tidak menguap, dilarutkan, dan dimuat dalam sebuah sumur dalam masing-masing
piring masing-masing. Yang terakhir adalah burung di 37ºC dan diperiksa untuk ZOI, lingkaran jelas
di sekitar wells, setelah interval waktu yang teratur (12 h, 16 h, 24 h, dan 32 h). Mengisolasi menampilkan
properti penghambatan luar biasa dipelihara untuk analisa lebih lanjut. APS dengan sedikit penghambatan
properti diuji ulang di μL 30 dan 40 μL per baik dan dibuang jika tidak mencukupi antibiotik
biosintesis bertahan. Kami menggunakan fotografi pixel kuantifikasi (Adobe Photoshop CS6)
untuk membedakan isolat yang dikembangkan strategis penghambatan paling unpenetrated [12].
Perbedaan dalam kerapatan piksel dalam piring dan ZOI area dihitung dan
digunakan untuk menetapkan nilai potensi penghambatan mulai dari 0-5 untuk masing-masing isolat; jumlah ini
nilai ditentukan antibiotik potensi (A.P). Yang terakhir, bersama dengan ZOI diameter
pengukuran dan kisaran patogen inhibisi (yaitu nomor patogen dihambat),
digunakan untuk menghitung patogen penghambatan Index (P.I.I) dari setiap isolat, menyediakan
potensi penghambatan pertumbuhan pandangan holistik isolat:
2.4 isolasi DNA Plasmid
APSs disaring ditandai untuk kehadiran pDNA. pDNA begitu diisolasikan
semalam tumbuh APSs (OD600 2.2-2.5) menggunakan PureLink
TM
cepat Plasmid Miniprep kit
(Invitrogen, USA). PDNA terisolasi divisualisasikan pada 1% (w/v) agarose gel
Elektroforesis ternoda dengan ethidium bromida.
2.5 analisis filogenetik
DNA selular dari tiga APSs: Y14p, Y16 dan Y40p, yang bersama analog morfologi
dan properti penghambatan pertumbuhan seperti kebanyakan tanah mengisolasi, diambil menggunakan PureLink ™
DNA genom MiniKit K1820-01 (Invitrogen, USA). 16S rRNA gen urutan dari
APSs ini tiga itu kemudian diperkuat menggunakan universal primer (F-518:
CCAGCAGCCGCGGTAATACG, R-800: TACCAGGGTATCTAATCC) dan sequencing di
Macrogen Service Center (Rockville, MD, USA). Semua urutan dibandingkan dengan terdekat
kerabat dari GenBank dan Ribosomal Database proyek (RDP) rilis 10
(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp). Filogenetik dibangun oleh bergabung dengan tetangga
metode (NJ) dengan penghapusan pairwise kesenjangan dalam RDP database.
2.5.1 nomor aksesi urutan nukleotida
urutan-urutan semua murni budaya telah disimpan dalam database GenBank di bawah
aksesi nomor JQ956432, JQ956433, dan JX121858 untuk Y14, Y16 dan Y40,
masing-masing.
2.6 analisis statistik
Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dan hasil percobaan mewakili
berarti tiga identik set percobaan. Sekali jalan ANOVAs, diikuti oleh paling signifikan
perbedaan (Tukey's jujur signifikan perbedaan) dilakukan untuk mengevaluasi potensi
perbedaan signifikan.
3. HASIL dan diskusi
3.1 isolasi Mikroorganisme menghasilkan antibiotik
Seleksi utama tanah tempat tinggal dan rekreasional menghasilkan total 71 dan 9
menjanjikan APS dengan pertumbuhan properti penghambatan, masing-masing
tabel 1. Jumlah tanah tempat tinggal dan rekreasional mengisolasi menampilkan antibioticproducing kapasitas berbeda penyaringan tahap
ternyata semua isolat yang dipilih dari penyaringan primer kembali diputar oleh PCPM. Kebanyakan isolat
Diperoleh dari situs rekreasi menunjukkan kurangnya kapasitas penghambatan terhadap semua sembilan belas
patogen mikroorganisme selama pemeriksaan sekunder. Hanya satu mengisolasi (L59) dari
situs rekreasi terus-menerus dipamerkan properti penghambatan pertumbuhan, menghambat B. cereus, C.
albicans, P. fluorescence, S. aureus, dan S. zooepidemicus pada NA media (Tabel 2). The
berbagai macam isolat dari sampel tanah perumahan, yaitu 11 (21.2%), 4 (33,3%), dan 4
(57.5%) mengisolasi, cukup pertumbuhan ditampilkan properti penghambatan NA, PDA dan TSA
media, masing-masing (Tabel 1). Rekreasi tanah tidak mengungkapkan isolat dengan penghambatan pertumbuhan
properti pada medium TSA atau PDA, dan secara keseluruhan menghasilkan APS hampir enam kali lebih sedikit daripada
perumahan tanah (Tabel 1, P =. 05).
Tabel 2. Tanah mengisolasi menampilkan properti penghambatan pertumbuhan yang kuat setelah menengah
pemutaran oleh salib-piring assay terhadap 19 patogen pada tiga media yang berbeda
ATCC
patogen
Gram
pewarnaan
NA PDA TSA.
satu sisa rekreasi berasal dari tanah isolat (L59) tetap bertahan melalui pemeriksaan ini. Secara keseluruhan,
sebanyak 15 berbeda memproduksi antibiotik isolat dengan potensi penghambatan cukup
terisolasi dan selanjutnya ditandai. Tunggal rekreasi sisanya berasal dari tanah isolate
(L59) bertahan melalui pemeriksaan ini. Secara keseluruhan, total 15 berbeda antibiotik memproduksi
organisme dengan potensi penghambatan cukup terisolasi dan selanjutnya ditandai. Selama
penelitian kami, kapasitas penghambatan isolat berganti-ganti di tahap penyaringan yang berbeda. Beberapa
tahap mereka ditampilkan pertumbuhan kemampuan penekanan terhadap patogen tertentu tetapi kehilangan atau
beralih kemampuan ini penghambatan terhadap patogen lain selama tahap penyaringan berbeda
(Tabel 1 - 2). Pengamatan ini dapat menunjukkan adanya sangat spontan antibioticspecificity menukar terlibat interdependently dalam antibiotik sintesis antara tanah isolat dalam mikro yang optimal, dan dukungan studi sebelumnya yang menentukan kuat
pengaruh tetangga mikroorganisme di sekitarnya sekresi antibiotik bakteri [13].
3.2 penghambatan pertumbuhan penilaian
Nilai-nilai individu rata-rata zona inhibisi (ZOI) setiap isolat diringkas dalam tabel
3, dan mengungkapkan Y14 dengan ZOI terbesar (10.16 mm), menunjukkan terhadap patogen K.
kristinae PDA media. Mengisolasi Y13 dipamerkan pinggirannya penghambatan maksimum terhadap S.
marcescess (9,40 mm). Y14p dan Y44 ditampilkan mereka maksimum strategis penghambatan terhadap
K. kristinae (10.16 mm dan 2,01 mm, masing-masing). Y16 dan Y67p ditampilkan terbesar mereka
strategis penghambatan terhadap L. monocytogenes (2,54 mm dan 2,54 mm). Y16a mengungkapkan
maksimum ZOI terhadap O. anthropi (2,54 mm). Y17p mengisolasi dipamerkan maksimum yang
perimeter penghambatan terhadap P. fluorescence, C. albicans dan S. aureus (2,54 mm, 2.54 mm,
dan 2.54 mm). Y29p ditampilkan dalam zona penghambatan terbesar terhadap P. fluorescence dan S.
aureus (2,54 mm dan 2,54 mm). Demikian pula, Y39 telah pinggirannya penghambatan terbesar terhadap
En. saccharolyticus (2,29 mm). Y40p perimeter penghambatan terbesar adalah melawan P.
fluoresensi (2,54 mm). Isolat tersebut Y49 dan L59 adalah maksimum penghambatan perimeter
terhadap S. aureus (6.35 mm dan 6,10 mm). Y63p ZOI terbesar adalah melawan S.
zooepiderimicus (3,81 mm). Y64a maksimum ZOI adalah melawan C. albicans (2,54 mm). Y64b
ZOI terbesar adalah melawan L. monocytogenes (5.08 mm).
selanjutnya, APSs antibiotik potensi (A.P) dan rata-rata berkisar dari penghambatan pertumbuhan
patogen mikroorganisme ditentukan. Isolat Y17p andY14p menunjukkan
A.P terbesar, yang dipelihara terhadap P. fluorescence (A.P. = 5) dan M. luteus (A.P. =
5), masing-masing. Y63p namun memiliki jangkauan terluas inhibisi patogen, mengungkapkan
pertumbuhan kapasitas penekanan terhadap lebih dari 60% dari disaring secara klinis relevan
patogen L. monocytogenes, En. saccharolyticus, K. kristinae, K. faecalis, M. luteus, O.
anthropi, S. cerevisiae, S. aureus, S. scuiri, dan S. zooepiderimicus. Antara terisolasi
mikroorganisme, isolat Y14p, Y63p, dan Y13 telah P.I.I terbesar (yaitu 35,3, 26,1, dan
25,3), masing-masing, kombinasi dari jangkauan mereka inhibisi patogen, A.P dan ZOI
adalah terbesar (Fig. 1a). Isolat Y44, dan Y39 menunjukkan A.P,
respectively yang terlemah. Isolat tidak mampu menghambat K. pneumoniae, K. oxytoca, dan S. thermophilus.
sebagai antisipasi, ada korelasi positif antara A.P, P.I.I (c.c=0.85, P = 05), ZOI
(c.c=0.92, P = 05), dan kisaran inhibisi patogen (Fig. 1 d; c.c= 0,76; P = 05) (Fig. 1
b, c
gambar 1. Rata-rata indeks penghambatan patogen tanah isolat
A: beberapa tanah mengisolasi ditinggikan mengungkapkan berarti indeks patogen. B: korelasi positif ditampilkan
antara APS' potensi antibiotik dan patogen penghambatan indeks (korelasi koefisien = 0.96, P =
. 05). Berarti (± S.E.M). C: Menunjukkan korelasi positif antara potensi antibiotik dan zona
inhibisi pengukuran (c.c=0.84, p mengatakan 0,05). Berarti (± S.E.M). D: korelasi positif ditampilkan
antara berbagai patogen inhibisi dan indeks penghambatan patogen (c.c=-0.20, * P = 05)
3.3 deteksi DNA Plasmid
untuk menentukan unsur-unsur molekul yang mungkin terlibat dalam produksi antibiotik dalam situs
Tanah tertentu mengisolasi, kita mencari keberadaan DNA plasmid dan menemukannya di beberapa perumahan
tanah berasal dari APSs, di Ruangan Khusus

Hasil (Bahasa Indonesia) 2:

2.1.1 assay produksi Antibiotik
Karena potensi signifikansi industri mereka, kami bertujuan untuk menyelidiki antibiotik
kemampuan mensekresi antara disaring APSS. Sekunder disaring APSS dan kosong
kontrol ditumbuhkan dalam 50 ml medium pertumbuhan cair masing-masing (TSB, PDB, dan NB) pada
37 º C, 120 rpm selama 24 jam. Sel pellet (OD600 2,2-2,5) dengan sentrifugasi pada 22 º C,
10.000 g selama 10 menit. Supernatan dikumpulkan dan diuapkan oleh aliran udara steril
inkubasi pada 37 º C. Supernatan kering itu disterilkan dan dilarutkan dalam 1 ml
medium pertumbuhan masing-masing dan disimpan pada suhu -20 º C sampai dianalisis untuk sifat antibiotik
melalui agar-plug assay.
2.3 Agar-Plug Assay
Agar-plug assay diadopsi dari Bechard et al. [11] dengan 5-mm gabus steril penggerek digunakan
untuk plug sumur di masing-masing piring agar (NA, PDA, dan TSA) lawned dengan patogen. Setiap
sumur diisi dengan 20 uL supernatan dilarutkan, masing-masing. Secara paralel, pertumbuhan kosong
media dengan tidak ada organisme diuapkan dilarutkan, dan dimuat di sebuah sumur dalam setiap
piring masing-masing. Yang terakhir diinkubasi pada suhu 37 º C dan diperiksa untuk Zoi, lingkaran yang jelas
di sekitar sumur, setelah interval waktu yang teratur (12 jam, 16 jam, 24 jam, dan 32 jam). Isolat menampilkan
sifat penghambatan yang luar biasa disimpan untuk analisa lebih lanjut. APS dengan penghambatan sedikit
sifat diuji ulang pada 30 uL dan 40 uL per sumur dan dibuang jika antibiotik tidak cukup
biosintesis bertahan. Kami menggunakan kuantifikasi pixel fotografi (Adobe Photoshop CS6)
untuk membedakan mana isolat mengembangkan perimeter penghambatan paling unpenetrated [12]. The
perbedaan densitas pixel antara pelat melesat dan daerah Zoi yang dihitung dan
digunakan untuk menentukan nilai potensi penghambatan berkisar 0-5 untuk setiap isolat; jumlah ini
nilai ditentukan Antibiotik Potensi (AP). Yang terakhir, bersama dengan Zoi diameter
pengukuran dan berbagai penghambatan patogen (yaitu jumlah patogen terhambat),
digunakan untuk menghitung Indeks Hambat Patogen (PII) dari masing-masing isolat, memberikan
pandangan holistik isolat 'potensi penghambatan pertumbuhan:
2,4 Plasmid DNA Ekstraksi
disaring APSS yang ditandai untuk kehadiran pDNA. pDNA diisolasi dari
semalam tumbuh APSS (OD600 2,2-2,5) menggunakan PureLink
TM
Cepat Plasmid Miniprep kit
(Invitrogen, USA). The pDNA terisolasi divisualisasikan pada 1% (w / v) gel agarose
elektroforesis diwarnai dengan ethidium bromide.
2,5 filogenetik Analisis
Seluler DNA dari tiga APSS: Y14p, Y16 dan Y40p, yang berbagi morfologi analog
dan pertumbuhan sifat penghambatan karena kebanyakan tanah isolat, adalah diekstraksi menggunakan PureLink ™
Genomic DNA MiniKit K1820-01 (Invitrogen, USA). The 16S rRNA urutan gen dari
tiga APSS kemudian diperkuat dengan menggunakan primer yang universal (F-518:
CCAGCAGCCGCGGTAATACG, R-800: TACCAGGGTATCTAATCC) dan sequencing di
Macrogen Service Center (Rockville, MD, USA). Semua urutan dibandingkan dengan terdekat
kerabat dari Proyek database GenBank dan ribosomal (RDP) merilis 10
(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp). Pohon filogenetik yang dibangun oleh tetangga-bergabung
metode (NJ) dengan penghapusan berpasangan kesenjangan dalam database RDP.
2.5.1 Nukleotida nomor urut aksesi
Urutan dari semua budaya murni telah disimpan dalam database GenBank di bawah
nomor aksesi JQ956432, JQ956433, dan JX121858 untuk Y14, Y16, Y40 dan,
masing-masing.
2.6 Analisis Statistik
Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga, dan hasil eksperimen mewakili
rata-rata tiga set identik percobaan. ANOVAs satu arah diikuti oleh paling signifikan
perbedaan (selisih jujur ​​signifikan Tukey) dilakukan untuk mengevaluasi potensi
perbedaan yang signifikan.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Isolasi Antibiotik-Memproduksi Mikroorganisme
The skrining utama tanah perumahan dan rekreasi menghasilkan total 71 dan 9
APS menjanjikan dengan pertumbuhan sifat penghambatan, masing-masing
Tabel 1. Hitung tanah perumahan dan rekreasi isolat menampilkan kapasitas antibioticproducing pada tahap screening yang berbeda
Semua isolat yang dipilih dari skrining utama itu kembali disaring oleh PCPM. Sebagian besar isolat
yang diperoleh dari situs rekreasi menunjukkan kapasitas penghambatan memadai terhadap semua sembilan belas
mikroorganisme patogen selama pemutaran sekunder. Hanya satu isolat (L59) dari
situs rekreasi tubi dipamerkan sifat penghambatan pertumbuhan, menghambat B. cereus, C.
albicans, P. fluoresensi, S. aureus, dan S. zooepidemicus pada media NA (Tabel 2). The
berbagai isolat dari sampel tanah perumahan, yaitu 11 (21,2%), 4 (33,3%), dan 4
(57,5%) isolat, ditampilkan pertumbuhan yang cukup sifat penghambatan pada NA, PDA, dan TSA
media, masing-masing (Tabel 1) . Tanah rekreasi tidak mengungkapkan isolat dengan pertumbuhan penghambatan
properti di TSA atau PDA menengah, dan secara keseluruhan menghasilkan hampir enam kali APS kurang dari
tanah perumahan (Tabel 1, P = .05).
Tabel 2. Tanah isolat menampilkan pertumbuhan yang kuat sifat penghambatan setelah sekunder
pemutaran dengan uji cross-plate terhadap 19 patogen pada tiga media yang berbeda
ATCC
Patogen
Gram
pewarnaan
PDA NA TSA.
Sisanya rekreasi isolat tanah yang diturunkan tunggal (L59) bertahan melalui pemeriksaan ini. Secara keseluruhan,
total 15 berbeda antibiotik-memproduksi isolat dengan potensi penghambatan yang cukup yang
diisolasi dan selanjutnya ditandai. Rekreasi isolat tanah yang diturunkan sisa tunggal
(L59) bertahan melalui pemeriksaan ini. Secara keseluruhan, total 15 antibiotik-produksi yang berbeda
organisme dengan potensi penghambatan yang cukup diisolasi dan selanjutnya ditandai. Selama
penelitian kami, isolat 'kapasitas penghambatan berganti-ganti pada tahap screening yang berbeda. Pada beberapa
tahap mereka ditampilkan kemampuan penekan pertumbuhan terhadap patogen tertentu tetapi hilang atau
beralih kemampuan ini penghambatan terhadap patogen lain selama tahap screening yang berbeda
(Tabel 1-2). Observasi ini mungkin menunjukkan adanya swapping antibioticspecificity sangat spontan yang terlibat dalam sintesis interdependently antibiotik antara isolat tanah dalam sebuah lingkungan mikro yang optimal, dan mendukung penelitian sebelumnya yang menentukan kuat
pengaruh mikroorganisme tetangga di sekitarnya sekresi antibiotik bakteri [13].
3.2 Penilaian Pertumbuhan-Hambat
nilai-nilai individu rata-rata zona inhibisi (Zoi) dari masing-masing isolat dirangkum dalam Tabel
3, dan mengungkapkan Y14 dengan Zoi terbesar (10.16mm), berdemonstrasi menentang patogen K.
kristinae pada media PDA. Isolat Y13 dipamerkan perimeter penghambatan yang maksimal terhadap S.
marcescess (9.40mm). Y14p dan Y44 ditampilkan perimeter penghambatan maksimum mereka melawan
K. kristinae (10.16mm dan 2.01mm, masing-masing). Y16 dan Y67p ditampilkan mereka terbesar
perimeter penghambatan terhadap L. monocytogenes (2.54mm dan 2.54mm). Y16a mengungkapkan
Zoi maksimal terhadap O. anthropi (2.54mm). Isolat Y17p dipamerkan maksimum
perimeter penghambatan terhadap P. fluoresensi, C. albicans dan S. aureus (2.54mm, 2,54 mm,
dan 2,54 mm). Y29p ditampilkan penghambatan zona terbesar terhadap P. fluoresensi dan S.
aureus (2.54mm dan 2.54mm). Demikian pula, Y39 memiliki hambat perimeter terbesar terhadap
En. saccharolyticus (2.29mm). Y40p terbesar penghambatan perimeter melawan P.
fluoresensi (2.54mm). Isolat Y49 dan L59 maksimum perimeter penghambatan itu
terhadap S. aureus (6,35 mm dan 6,10 mm). Y63p terbesar Zoi melawan S.
zooepiderimicus (3.81mm). Y64a maksimum Zoi melawan C. albicans (2.54mm). Y64b
Zoi terbesar adalah melawan L. monocytogenes (5,08 mm).
Selanjutnya, APSS potensi antibiotik (AP) dan jangkauan rata-rata penghambatan pertumbuhan
mikroorganisme patogen ditentukan. Isolat Y17p andY14p menunjukkan
terbesar AP, yang diamati terhadap P. fluoresensi (AP = 5) dan M. luteus (AP =
5), masing-masing. Y63p namun memiliki jangkauan terluas penghambatan patogen, mengungkapkan
kapasitas penekan pertumbuhan terhadap lebih dari 60% dari disaring klinis relevan
patogen L. monocytogenes, En. saccharolyticus, K. kristinae, K. faecalis, M. luteus, O.
anthropi, S. cerevisiae, S. aureus, S. scuiri, dan S. zooepiderimicus. Di antara terisolasi
mikroorganisme, isolat Y14p, Y63p, dan Y13 memiliki PII terbesar (yaitu 35,3, 26,1, dan
25,3), masing-masing, sebagai kombinasi dari jangkauan mereka penghambatan patogen, AP, dan Zoi
adalah yang terbesar (Gambar 1a) . Isolat Y44, Y39 dan menunjukkan AP terlemah,
masing-masing. Tidak ada isolat mampu menghambat K. pneumoniae, K. oxytoca, dan S. thermophilus.
Sebagai antisipasi, ada korelasi positif antara AP, PII (cc = 0,85, P = .05), Zoi
(cc = 0,92, P = .05 ), dan berbagai patogen inhibisi (Gambar 1d, cc = 0,76, P = .05) (Gambar 1
b, c
.. Gambar 1 Berarti patogen indeks penghambatan tanah isolat
A: Beberapa tanah isolat menunjukkan peningkatan indeks patogen rata-rata . B: korelasi positif yang ditampilkan
antara potensi antibiotik APS 'dan Pathogenic Hambat Indeks (koefisien korelasi = 0,96, P =
.. .05) Berarti (± SEM) C: korelasi positif ditunjukkan antara potensi antibiotik dan zona
pengukuran inhibisi (cc = 0,84 ., p> 0,05) rata-rata (± SEM) D:. korelasi positif yang ditampilkan
antara kisaran penghambatan patogen dan Hambat Indeks Pathogenic (cc = -0.20, * P = .05)
3.3 Deteksi Plasmid DNA
Untuk menentukan elemen molekul yang mungkin terlibat dalam produksi antibiotik dalam situs
tanah spesifik isolat, kami mencari keberadaan DNA plasmid dan menemukannya di beberapa perumahan
tanah yang diturunkan APSS, ditunjuk